[发明专利]一种酶法间接定量检测非法添加舒巴坦的方法及其试剂盒

说明书

本发明属于酶法分析、生物检测领域，提供了一种去除内源β‑内酰胺酶的方法及其在检测舒巴坦中的应用。同时，本发明提供了一种酶法间接检测内源β‑内酰胺酶抑制剂舒巴坦的方法。

技术领域

本发明涉及一种用于酶法间接定量检测β-内酰胺酶抑制剂的方法和试剂盒，属于酶法分析、生物检测领域。

背景技术

近年来，滥用抗生素是政府监管机构重点监测和打击的行为。农业部及市场监督管理局等部门多年对乳及乳制品兽药残留的监测过程中，时有发现β-内酰胺类药物残留超标，然而，一些生产经营者通过添加拮抗剂β-内酰胺酶对β-内酰胺类药物进行降解来逃避监测。随着β-内酰胺酶检测方法的建立，部分生产经营者开始非法添加β-内酰胺酶抑制剂，例如舒巴坦，来抑制β-内酰胺酶的活性，从而使有关部门难以检测到β-内酰胺酶。因此，亟需快速、有效的方法来检测食品中非法添加的β-内酰胺酶抑制剂。

目前，国内外主要采用高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等方法来直接检测β-内酰胺酶抑制剂，例如专利CN101852780A涉及用高效液相色谱法(HPLC)直接检测舒巴坦。这些方法的操作复杂，检测设备的价格高昂，导致检测成本居高不下，无法满足检测行业快速发展的需求。另外，全红等人(分光光度法测定注射用头孢哌酮钠/舒巴坦钠药物含量，全红等，山西医科大学学报，2003年12月，34(6)：573-574)采用分光光度计法来直接测定舒巴坦，但由于分光光度法用量较大、浪费较多，极少用于工业化的食品检测。

在食品检测方法中，酶法检测技术的成本相对较低，但由于食品样品成分复杂，干扰很大，导致酶检测的准确度和精确度在很多情况下都达不到行业的要求，例如李亮等(不同条件下酶法测定蜂蜜中甘油含量的研究，李亮等，中国农业科技导报，2018，20(2):86－92)采用酶法测定蜂蜜中甘油含量时发现，酶制剂法的检测精度只能达到基本的要求，即精确度低，只能够基本满足重复性的要求。

发明内容

为了克服上述现有方法的不足，本发明的目的是提供一种可高通量、可标准化的、经济快速、准确检测β-内酰胺酶抑制剂的方法和相关试剂盒。

为了实现上述目的，本发明试图避开直接检测β-内酰胺酶抑制剂，而采用间接酶法检测β-内酰胺酶抑制剂。然而，实现这种方法需要解决如下技术难题：

首先，去除内源β-内酰胺酶。现有的样品预处理技术主要关注去除样品中含量较多的、普遍存在的各类杂质，如一些糖类、脂类或蛋白等，其目的是为了尽量减少反应的本底，降低不相关的非特异结合。然而，样品中内源β-内酰胺酶通常含量很少，即它不是通常意义上的杂质，但却与本发明方法中外加的β-内酰胺酶一样，能直接地、特异地与显色底物进行专一的酶反应，从而极大地影响测定结果的准确性。因此，常规的样品预处理方案只能去除大部分干扰杂质，对微量的内源β-内酰胺酶去除效果不佳。据发明人所知，目前还没有针对性去除样品中(尤其是乳品中)内源β-内酰胺酶的好方法，发明人曾试着采用已有的预处理试剂如丙酮、三氯醋酸、乙酸锌、亚铁氰化钾、硫酸铵、乙醚、乙醇、盐酸胍、SDS等(不一一例举)对样品进行预处理，效果都不理想，原因不明。发明人意外发现以本发明的样品处理液I和样品处理液II联合对样品进行预处理的效果最好，并且进一步找到了适于工业化的、能在微孔板中进行检测的最经济用量。

其次，在微孔板的狭小体系中保证加标回收率及变异系数等均能达到行业要求。与分光光度法不同，使用酶标微孔板能极大地缩小反应体系，从而避免试剂等的浪费，更适合食品检测行业推广使用，但由于体积过小，试剂配制误差、酶活性及浓度、反应温度、反应时间、反应体系组成等细节都可能极大地影响测定结果，难以形成符合行业要求的检测方法。因此，鲜有人用微孔板酶法检测β-内酰胺酶抑制剂的报道。发明人尝试对这一复杂的检测过程进行拆分，对每个细节进行反复实验，力图探索得到每个细节的优化条件，最终获得一套完整的、最佳的、适于标准化检测β-内酰胺酶抑制剂的方法和相关试剂盒。