[发明专利]监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针及制备和应用

说明书

本发明涉及pH荧光探针技术领域，具体涉及监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针及制备和应用。其制备方法是：将2‑(2‑氨基乙基)‑3'，6'‑双(二乙氨基)螺环[异吲哚‑1,9'‑黄原]‑3‑酮和2‑(2‑甲氧基乙氧基)4‑甲基苯磺酸乙酯溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，加热回流制得粗品；将粗品除去溶剂，经硅胶柱分离得到纯品。通过细胞毒性测试表明本发明对细胞几乎没有毒副作用，进而通过细胞共定位实验确定该探针能够专一性靶向细胞溶酶体，激光共聚焦显微成像实验表明本发明的探针具有良好的细胞膜渗透性，并能对溶酶体内pH的变化进行高灵敏检测。本发明的探针可以通过检测溶酶体内pH的变化来监测细胞的自噬过程。

技术领域

本发明涉及pH荧光探针技术领域，具体涉及监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针及制备和应用。

背景技术

自噬(autophagy)是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome)，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。细胞自噬作为生物体中一种非常重要的代谢途径，是细胞成分降解和回收利用的基础，在细胞中起着“清道夫”的作用。传统的自噬监测策略是基于扫描电子显微镜(TEM)，通过蛋白免疫印迹(Atg8/LC3)或基因编码的荧光蛋白法(GFP-LC3/p62)监测自噬体相关蛋白。然而，这些方法通常具有局限性，如扫描电镜和蛋白免疫印迹法通常需要进行细胞固定以使细胞易于获得抗体，即无法监测活细胞自噬状态；同时，荧光蛋白法需要复杂的设计和转染过程，不允许长时间的自噬监测，再加上GFP-LC3容易在酸性自噬溶酶体中的降解以及GFP的荧光猝灭等，通过上述方法很难实现对活细胞自噬的快速、实时、低成本的监测。因此以一种高效和经济的方式来观察自噬仍然是一个巨大的挑战。

溶酶体是真核细胞中一种具有单层膜结构的细胞器，内含许多水解酶，用来分解多种外源性和内源性生物大分子物质或细胞自身的局部细胞质或细胞器等。一般来说，自噬发生时，自噬体的膜会和溶酶体的膜进行融合形成自噬溶酶体，使内容物在酸性pH值(4.5～5.5)的水解酶的帮助下降解和再循环。在自噬的膜融合过程中，由于溶酶体和自噬体的差异，溶酶体pH值等微环境会发生变化。因此，我们可以通过检测溶酶体内pH的变化来监测自噬进行的程度。

目前文献报道了许多检测溶酶体pH变化的荧光探针，然而由于这些探针的激发和发射波长大多处于紫外区域，与细胞自发荧光相互交叠，造成背景荧光较强，且紫外光对细胞的毒副作用较大，因而不适合长时间的检测。此外，现有溶酶体靶向基团集中于传统的吗啉环和二甲氨基结构，这类弱碱性基团容易聚集在弱酸性溶酶体中引起溶酶体的“碱化效应”，长时间作用会导致细胞中毒。因此，需要开发新型的溶酶体靶向探针用于溶酶体内pH的检测。本发明引入能够有效避免溶酶体的“碱化效应”的二乙二醇单甲醚为新型溶酶体靶向基团，利用具有优良pH响应荧光性质的罗丹明B为荧光团母体结构，设计合成了新型pH荧光探针RML，通过对细胞溶酶体内pH的特异性检测实现对细胞自噬过程的监测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种溶酶体靶向pH荧光探针RML的制备方法；目的之二是提供该荧光探针的用途，即用于制备动物细胞自噬过程中溶酶体内pH的检测试剂。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的结构式为：

一种监测细胞自噬的溶酶体靶向pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)将2-(2-氨基乙基)-3'，6'-双(二乙氨基)螺环[异吲哚-1,9'-黄原]-3-酮和2-(2-甲氧基乙氧基)4-甲基苯磺酸乙酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加热回流反应，体系冷却至室温，减压旋蒸除去N,N-二甲基甲酰胺溶剂制得粗品；