[发明专利]构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种构建mRNA链特异文库的方法，其特征在于：

包括：

准备mRNA片段、放线菌素D、具有RNA酶抑制剂和逆转录酶的第一混合酶液和具有第一dNTP的第一缓冲液并进行混合作为第一反应体系，并且使所述第一反应体系进行第一热处理，在所述第一热处理中，以mRNA片段为模板合成cDNA第一链，获得第一反应液，其中，所述逆转录酶为核糖核酸酶H活性缺失的MMLV逆转录酶，所述第一dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物，所述mRNA片段经片段化处理，并且所述片段化处理于片段化缓冲液与mRNA样本混合成的片段化反应体系中进行，所述片段化缓冲液包括Tris-HCl、镁离子和随机六聚体引物，在所述片段化反应体系中，所述镁离子的工作浓度为0.3mM至1.0mM；

将所述第一反应液与具有DNA 聚合酶I、核糖核酸酶H、T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq-B DNA聚合酶和Klenow片段的第二混合酶液、以及具有第二dNTP的第二缓冲液进行混合作为第二反应体系，并且使所述第二反应体系进行第二热处理，在所述第二热处理中，以cDNA第一链为模板合成含尿嘧啶的cDNA第二链，接着对由所述cDNA第一链和所述cDNA第二链组成的cDNA进行末端修复和末端加A，形成第二反应液，其中，所述Klenow片段缺乏5'端至3'端的缺口平移用的核酸酶活性和3'端至5'端的校正用的核酸酶活性，所述第二dNTP为dATP、dUTP、dCTP和dGTP的混合物；

将所述第二反应液与T4 DNA连接酶、具有二甲基亚砜的第三缓冲液和Y字型接头进行混合作为第三反应体系，并且使所述第三反应体系进行第三热处理，在所述第三热处理中，使cDNA与Y字型接头连接，在所述第三热处理之后，进行纯化而获得第三反应液；并且

在所述第三反应液中添加具有扩增酶的预混液、扩增引物和尿嘧啶DNA糖基酶混合作为第四反应体系，并且使所述第四反应体系进行第四热处理，在所述第四热处理中，使含尿嘧啶的cDNA第二链降解，接着以cDNA第一链为模板进行扩增反应，在所述第四热处理之后，进行纯化而获得mRNA链特异文库。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

在所述第一反应体系中，所述放线菌素D的工作浓度为0.01g/L至0.05g/L，所述MMLV逆转录酶的工作浓度为8 U/μL至12U/μL，所述RNA酶抑制剂的工作浓度为1.0 U/μL至1.5U/μL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

在所述第二反应体系中，所述DNA 聚合酶I的工作浓度为0.6 U/μL至1U/μL，所述糖核酸酶H的工作浓度为0.1 U/μL至0.2U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.05 U/μL至0.1U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.3 U/μL至0.5U/μL，所述Taq-B DNA聚合酶的工作浓度为0.04 U/μL至0.08U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.08 U/μL至0.12U/μL。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述第一缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钾和二硫苏糖醇，

在所述第一反应体系中，所述第一dNTP的工作浓度为0.3mM至0.7mM，所述Tris-HCl的工作浓度为0.03M至0.06M，所述氯化镁的工作浓度为2.0mM至2.5mM，所述氯化钾的工作浓度为0.03M至0.08M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为6mM至10mM。

5.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于：

所述第二缓冲液还包括Tris-HCl、氯化镁、氯化钠、二硫苏糖醇、dATP和ATP；

在所述第二反应体系中，所述第二dNTP的工作浓度为0.3mM至0.6mM，所述Tris-HCl的工作浓度为6mM至10mM，所述氯化镁的工作浓度为0.2mM至0.5mM，所述氯化钠的工作浓度为0.03M至0.06M，所述二硫苏糖醇的工作浓度为3mM至6mM，所述dATP的工作浓度为1.2mM至1.4mM，所述ATP的工作浓度为0.7mM至1mM。