[发明专利]一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29DNA聚合酶突变体及其应用，突变体由SEQ ID NO.1所示的Phi29DNA聚合酶中氨基酸突变形成，具体氨基酸突变方式为：M97D，G197A，E221L，G350F，K402L，P428L，K493I，D503I和K512V。本发明的Phi29DNA聚合酶突变体具有9个突变位点，可长期存放于室温条件，与野生型相比，该突变体在DNA扩增反应中具有弱偏好性和更高的反应速率。本发明的Phi29DNA聚合酶突变体作为DNA聚合酶在DNA扩增中的应用，可以催化多重置换扩增，催化滚环复制反应；制备用于DNA测序或RNA测序的试剂盒。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体，及其在DNA扩增中的应用。

背景技术

Phi29 DNA聚合酶是枯草芽孢杆菌噬菌体phi29(Φ29)的执行基因组复制功能的DNA聚合酶，属于真核DNA聚合酶家族B。这种聚合酶具有特殊的链置换能力、出色的持续合成特性和保真性，因此被广泛应用于滚环复制和全基因组的多重置换扩增。然而，该酶的最适温度在30℃，热稳定性较差，限制了酶的存储期限和在有高温需求的扩增反应中的应用。此外，由于G/C在低温下会影响复制速率，在高温下进行基因组的多重置换扩增通常可以提高DNA产率和扩增均一性。目前已有多个公开报道针对该酶稳定性的工作，主要通过定向进化和构建嵌合体蛋白的手段；所以开发一种新型的稳定性高的、扩增性能好的Phi29 DNA聚合酶突变体十分重要。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种全新的Phi29 DNA聚合酶突变体，该新型全新的Phi29 DNA聚合酶突变体，解决了现有Phi29 DNA聚合酶热稳定性较差，提高酶的存储期限和在有高温需求的扩增反应中的应用；此外，克服了由于G/C在低温下会影响复制速率，在高温下进行基因组的多重置换扩增通常可以提高DNA产率和扩增均一性；是一种热稳定高、扩增均一性好和扩增效率高的Phi29 DNA聚合酶。

本发明还提供了Phi29 DNA聚合酶突变体的制备过程和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种提高热稳定、扩增均一性和扩增效率的Phi29 DNA聚合酶突变体，所述突变体由SEQ ID NO .1所示的Phi29 DNA聚合酶中氨基酸突变形成，具体氨基酸突变方式为：M97D， G197A， E221L， G350F， K402L， P428L，K493I， D503I和 K512V。

其中，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的Phi29 DNA聚合酶突变体热定性、扩增均一性、扩增效率高于野生型Phi29DNA聚合酶突变体。

本发明所述的Phi29 DNA聚合酶突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

SEQ ID NO .1