[发明专利]分泌番茄斑驳花叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

说明书

本发明公开了一种分泌抗番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus，ToMMV)单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用。以提纯的ToMMV病毒粒子为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能分泌抗ToMMV单抗的杂交瘤细胞株2D6，其保藏号为CGMMC NO.18846。该细胞株分泌单抗腹水间接ELISA效价达10^‑8，其与ToMMV发生特异性免疫反应，而不与同属的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)反应。利用2D6单抗建立检测番茄植株中ToMMV的ACP‑ELISA、dot‑ELISA和Tissue print‑ELISA检测方法，其中ACP‑ELISA和dot‑ELISA方法检测病叶的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释(w/v,g/mL)。分泌ToMMV高质量单抗杂交瘤细胞株的创制及该病毒血清学检测方法的建立为ToMMV的诊断和检测、流行病学调查及科学防控提供物质和技术支撑。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

番茄斑驳花叶病毒(ToMMV)是帚状病毒科(Viraviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的一个新种，基因组为正义单链RNA。ToMMV的基因组包含四个开放阅读框，与烟草花叶病毒一样，它表达四种蛋白质，编码1个126kD和1个183kD复制需要的蛋白，还编码1个30kD的运动蛋白和1个17.5kD的外壳蛋白。2013年该新病毒在墨西哥番茄上首次被发现，随后在美国、以色列、巴西、西班牙等地的番茄上检出该病毒，我国云南省与海南省的番茄也受到该病毒的侵染。

ToMMV可危害多种茄科作物，所致病害症状主要表现为植株矮化、叶片褪绿斑驳扭曲，引起严重的产品损失。该病毒具较高的稳定性，可在病残体中存活较长时间，并可附着在种表或以病残体混杂在种子中实现远距离传播，易经机械摩擦在植株间传染。我国主要茄科作物，如番茄、辣椒、烟草等多采用育苗移栽的方式栽培，部分番茄(如圣女果)还采用嫁接育苗，加之田间管理过程中需经多次打杈、整枝、上架及采果等操作，因此，该病毒一旦传入极易扩散流行。关于该病毒的发生规律、传播途径、病毒检测技术及病毒基因组功能的研究甚少。

为了调查我国多种茄科植物的该病害的发生情况、强化我国ToMMV检测和诊断技术及科学指导防控，急需建立检测ToMMV经济有效、高通量的实用检测技术。与常规的指示植物接种、电镜观察、分子检测等方法相比，血清学方法具有简单、经济、易操作、可大规模检测等优点，是植物病毒检测和调查最实用的方法。但血清学的方法的建立依赖于特异性高质量的病毒抗体。本发明以纯化的ToMMV病毒粒子作为抗原通过杂交瘤技术制备了1株分泌ToMMV特异性单抗的杂交瘤细胞株，以分泌的单抗为核心建立检测ToMMV的高通量的血清学方法及试剂盒，从而为我国ToMMV的检测诊断、流行病学的调查、病毒基因组功能分析、组培生产、抗性育种、科学防控建立等提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗番茄斑驳花叶病毒单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌番茄斑驳花叶病毒单抗的杂交瘤细胞株2D6，它能特异性分泌抗番茄斑驳花叶病毒的单抗，杂交瘤细胞株2D6于2019年11月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMMC NO.18846。

一种所述的杂交瘤细胞分泌的番茄斑驳花叶病毒单克隆抗体，抗ToMMV病毒单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-8，抗体类型及亚类为IgG_2a、κ轻链，与番茄斑驳花叶病毒17.5kDa的外壳蛋白有特异性免疫反应，利用该单抗建立的ACP-ELISA和dot-ELISA方法检测感染ToMMV番茄病叶组织粗提液的灵敏度分别达到1:40,960和1:20,480倍稀释(w/v,g/mL)。