[发明专利]一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用。重组空载体包括上下游同源臂，以及同源臂间设至少一个启动子和终止子，启动子和终止子之间插入与至少一个外源基因构成多顺反子结构的SEQ ID NO:7所示的碱基序列；其中，上游同源臂含SEQ ID NO:1所示碱基序列，下游同源臂含SEQ ID NO:2所示碱基序列。采用本发明的普通小球藻叶绿体稳定表达系统,可实现多个外源基因在叶绿体中稳定表达。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种普通小球藻叶绿体同源重组空载体及其应用。

背景技术

小球藻是绿藻门（Chlorphyta）、绿藻纲（Chlorophyceae）、绿球藻目（Chlorococcales）、小球藻科（ChlorellaAceae）、小球藻属（Chlorella ）的一类单细胞微藻。目前世界上已知的小球藻约 10 种，常见的有普通小球藻（Chlorella vulgaris)、小球藻（Chlorella zofingiensis）、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea）和原壳小球藻(Chlorella protothecoides）等。

小球藻是一种单细胞绿藻，其外形呈球形或椭圆形，直径为 3-12 µm，有单个游动细胞，也有聚集成群。小球藻广泛分布于自然界，生长繁殖速度快，是地球上动植物中唯一能20h增长4倍的生物，可以获得较高的细胞密度和生物量；且小球藻易于培养，既能利用光能和 CO₂进行光能自养，又能在利用有机碳源进行异养生长，是作为生物反应器的良好选择。小球藻不同的时期大小和外观颜色变化很大。在显微镜（1000x 油镜）下观察，对数生长期的小球藻个体较小，呈绿色，体内色素主要是叶绿素等进行光合作用的绿色色素；进入稳定期后，细胞个体变大，如果受到外界胁迫，小球藻颜色会变成黄色或者橘红色，细胞内主要色素是玉米黄质、叶黄素和虾青素等类胡萝卜素，保护细胞抵抗外界胁迫。小球藻繁殖为无性生殖，通过原生质体分裂而形成似亲孢子，每数个似亲孢子，母体细胞壁破裂后将孢子释放出来。似亲孢子自由生长形成营养细胞。

小球藻具有重要的商业应用价值，广泛应用在食品、医药、能源，水产养殖等领域。小球藻含有丰富的蛋白质，含量高达 50%-60%，可作为单细胞蛋白的一个重要来源，同时还含人和动物所必需的多种氨基酸、膳食纤维、维生素等营养成分。小球藻还具有低脂肪、低糖、低热量等优点，是一种优质的绿色营养源食品，在食品和保健食品等行业有巨大的经济价值。小球藻还可以作为鱼虾等动物的饲料，广泛应用于水产养殖业。

小球藻又被发现可以积累虾青素，有可能成为继雨生红球藻之后又一种优质的天然虾青素藻源。 小球藻中含有小球藻生长因子 COF、多糖和糖蛋白等多种有生物活性的物质，在医药方面对抗肿瘤、增强免疫力抗病毒感染等效果显著。还有报道有些小球藻细胞内油脂和脂溶性化合物含量较高，可用制备生物油。早在 1993 年，美国国家可更新能源实验室(NREL)就制定并已开展了遗传工程改造微藻增加烃产量的计划。

小球藻的基因工程研究起步也较早，在微藻中仅次于莱茵衣藻。目前适用于小球藻的遗传转化方法有电击转化法、基因枪转化法、农杆菌转染法等，都有较高的效率。以新霉素磷酸转移酶基因（NPT Ⅱ）基因为筛选标记基因，利用电击转化法已经建立了小球藻的细胞核稳定转化系统，并且已经得到了广泛的应用。但是小球藻细胞核转化方法存在一些问题，如：核基因组结构功能复杂，难以实现定向重组、定点突变；外源基因表达效率低，且表达不稳定。

叶绿体是小球藻中一个带有相对独立遗传物质的细胞器，小球藻中有且仅有一个大的杯型叶绿体。1988年，Boynton等通过基因枪法建立了莱茵衣藻的叶绿体转化系统，使人们认识到叶绿体可以作为基因工程中新的转化表达受体。与细胞核转化系统相比，叶绿体转化具有如下优势：原核表达系统、叶绿体基因组定点转化、无基因沉默、外源基因表达效率高且变异小等。因此开发小球藻的叶绿体遗传转化系统，对于小球藻的基础研究和应用开发具有重要价值。