[发明专利]一种利用滤膜实现外泌体富集的装置和外泌体富集方法

权利要求书

1.一种利用滤膜实现外泌体富集的装置用于外泌体富集的方法，其特征在于：

用于外泌体富集的装置包括：抽滤泵，滤器，滤膜；

滤器为一上下二端开口的容器，于容器中部横向设有支撑筛板，于支撑筛板上设有滤膜，于支撑筛板和容器下开口端之间的容器侧壁上设有抽气口，抽气口通过管路与抽滤泵；容器下开口端设有一滤液收集瓶；

外泌体富集的装置的使用过程为：用水、磷酸盐缓冲液（PBS）、乙醇溶液中的一种或两种以上清洗好直径2-5cm圆筒状滤器后，将5-100nm孔径的滤膜安装在滤器中；打开抽气泵后，用0.5-10mL水、磷酸盐缓冲液（PBS）中的一种清洗膜，抽干后在滤器膜上加入样品，进行抽滤；抽滤2-60min后，保证膜上残余液体为0-200μL；之后，加入体积为1-10mL的水、磷酸盐缓冲液（PBS）、0.05-1M的氯化钠溶液、体积浓度5-30%乙腈中的一种或两种以上进行膜的清洗，清洗1-5次，以尽可能多的洗掉杂质，膜上残余的样品即为收集的外泌体样品；

抽滤泵为一抽气泵，滤器为圆形筒体，筒体中部径向设有带有通孔的支撑筛板，滤膜直径略大于筒体直径，以防止漏液；

为实现外泌体的有效拦截及其杂质的有效去除，滤膜的孔径在5-100mm之间，滤膜的材质为：无机氧化铝（AAO），聚碳酸酯，硝酸纤维素中的一种或两种以上；

对于滤膜上的外泌体的回收可分为以下两种方式中的一种：

（1）用干净的镊子取下滤膜放于试管内，用0.2-5mL水、磷酸盐缓冲液（PBS）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）、3-8M尿素、质量浓度1-6% 十二烷基磺酸钠（SDS）、质量浓度0.1-2% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、质量浓度1-4%十二烷基麦芽糖苷（DDM）溶液中的一种或两种以上反复吹打膜表面或利用超声破碎或37-95℃高温煮膜即可得到含有外泌体的样品；

（2）在滤器上将滤膜上下面互换反向安装，在膜上加入0.2-5mL水、磷酸盐缓冲液（PBS）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）、3-8M尿素、质量浓度1-6% 十二烷基磺酸钠（SDS）、质量浓度0.1-2% 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、质量浓度1-4%十二烷基麦芽糖苷（DDM）溶液中的一种或两种以上，抽滤收集滤过的成分即为得到的外泌体样品。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

将得到的外泌体样品用于蛋白质组学分析，得到的外泌体样品加入5-20mM的还原剂（三(2-羧乙基)膦(TCEP)或者二硫苏糖醇（DTT））在37-95℃反应5-90min，后加入10-40mM的碘代乙酰胺（IAA）,在15-30℃下避光反应20-40min,之后进行溶液中酶解或者通过依赖滤膜辅助的样品处理方法（FASP）处理，以胰蛋白酶与原始蛋白量质量比1：15-1：50加入胰蛋白酶, 在37℃下10-18小时反应或者在紫外辅助下快速酶解0.5-6h；得到的溶液进行除盐处理后质谱分析或直接的质谱分析。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

将包含滤膜的装置通过抽滤作用用于外泌体的富集，同时，此装置也可应用于与超速离心，依赖聚合物沉降，尺寸排阻柱方法处理得到外泌体样品的联用中，实现更高纯度的外泌体的获取。