[发明专利]一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种过表达TAT‑KGF的干细胞上清液制备方法及其应用，本发明联用穿膜肽(TAT)来提高KGF的细胞透过率，利用分子克隆技术将TAT‑KGF融合基因克隆至生产用干细胞中，经筛选亚克隆后，获得稳定表达TAT‑KGF因子的干细胞株，加上该细胞株本身可自分泌FGF2，从而维持细胞的干细胞特性，避免其发生横向或纵向分化，使之成为具有长期传代和稳定表达细胞因子能力的工程细胞株，以保障生产用干细胞的稳定性和可持续性，从而达到产品质量的稳定。本发明公开了一种过表达TAT‑KGF的干细胞上清液制备方法及其应用，可行性高，且可产业化和衍生化，适用于制备不同来源的间充质干细胞，能够对不同起因的脱发进行治疗，脱发再生效果优异，实用性较高。

技术领域

本发明涉及生物干细胞技术领域，具体是一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用。

背景技术

脱发是当今普遍存在的一种“现代病”，虽不属于严重的疾病，但会对人的外观形象和心理造成负面影响，进而影响患者生活质量；脱发的类型很多，包括雄激素性脱发、斑秃、烧伤等创伤后的脱发。

近年来，人们生活习惯的不规律和学习工作量超负荷导致脱发患者逐年增多且趋于年轻化，目前，常用非那雄胺和米诺地尔来治疗脱发，虽然这两种药物有一定疗效，但停药后易复发，长期使用还会造成一定程度的副作用，如皮瘙痒、毛发干燥、头晕、冒冷汗、厌食、心肌梗塞等；而中医治疗的效果缓慢，长期服用还会引起患者对中药副作用的担心，如肝和肾毒性。因此，开发安全有效的治疗脱发的方法具有重要的实际意义及需求。

针对上述问题，我们需要设计一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用，能够有效对脱发进行治疗，这是我们亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法及其应用，以解决现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种过表达TAT-KGF的干细胞上清液制备方法，包括以下步骤：

1)间充质干细胞的制备；

2)将含有TAT-KGF的质粒转染至步骤1)获得的间充质干细胞，得到过表达干细胞；

3)利用有限稀释法进行亚克隆，构建稳定表达TAT-KGF的生产用干细胞；

4)进行生产用干细胞的扩增传代，并收集培养上清液，无菌分装为1ml/支，保存，即得成品。

干细胞是一种具有自我复制功能和多分化潜能的早期未分化细胞，医学界称之为“万用细胞”。干细胞具有各种各样的生物学特性，最主要的是具有自我更新和多向分化潜能及无限增殖能力。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一组源于基质的异质细胞群，可以从人体大多数组织获取。过去几年，间充质干细胞主要用于伤口组织的修复、促进新生血管的形成、刺激角质形成细胞参与表皮的再生及促进糖尿病足溃疡的愈合等，如今也常用于脱发的治疗。间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板样衍生生长因子(PDGF)、纤维连接蛋白(FN)等。其中，成纤维细胞生长因子(FGF)是一类来源于中胚层和神经外胚层的细胞分泌的具有重要生物活性的细胞生长因子，也是一类重要的促有丝分裂因子和促细胞分化的诱导因子。