[发明专利]一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)间充质干细胞的制备；

2)将步骤1)得到的间充质干细胞接种于培养皿中，无血清培养；

3)在培养基中加入当归提取物，继续培养并收集细胞培养上清液；

4)超速离心，得到所述干细胞外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)间充质干细胞的制备；

2)取步骤1)制备的间充质干细胞，用0.25％胰蛋白酶进行常规消化、收集细胞悬液；

3)用血球计数板进行计数，再按照1×10⁵个细胞/孔接种于6孔板中，在温度为37℃、湿度为95％、5％CO₂条件下培养24h，去除上清；

4)更换含有当归提取物的opti-MEM培养基，继续培养3天，并收集细胞培养上清液；

5)超速离心，得到所述干细胞外泌体。

3.根据权利要求2所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，包括以下步骤：

A.取步骤4)收集的细胞培养上清液，在4℃、350g下离心15分钟，得到一次离心上清液；

B.取步骤A得到的一次离心上清液，在4℃、7000g下离心10分钟，得到二次离心上清液；

C.取步骤B得到的二次离心上清液，在4℃、20000g下离心20分钟，得到三次离心上清液，再将三次离心上清液经0.22μM孔径滤膜过滤，得到滤液；

D.取步骤C得到的滤液，在4℃、130000g下离心1.5h，取沉淀物，加入pH为7.4的PBS缓冲液复溶，得到所述干细胞外泌体。

4.根据权利要求2所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤4)中，所述当归提取物的制备步骤为：取当归粉末，通过水提法进行提取得到提取液，过滤除去沉淀，浓缩冻干。

5.根据权利要求4所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤4)中，水提法提取当归粉末时，提取时间为1-3h，提取次数为1-3次，当归粉末与水的重量比为1：10。

6.根据权利要求2所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述当归提取物的浓度为1g/mL。

7.根据权利要求2所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述间充质干细胞来源于骨髓、脐带或子宫内膜。

8.根据权利要求7所述的一种当归提取物刺激的干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：

a)无菌条件下取近胎儿端脐带20cm，两端各剪去2cm，先用含200U青链霉素的生理盐水漂洗脐带4-5次，至无血迹，再用无双抗的生理盐水漂洗，放含少许DMEM/F12培养基的培养皿中，剪成2-3cm的小段，将小段纵向剪开，剔除脐带内动、静脉血管，用组织镊将组织块撕成细条状，放入含少量DMEM/F12培养基的培养皿中，用眼科剪剪成1-2mm³的组织块，整个过程在冰浴中进行；

b)将剪碎的组织块蘸上少许血清，移入透气T25培养瓶中，每瓶20个，加入1.5ml含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养48h后换液，待有细胞贴壁后更换培养基，培养约8-12天，去除组织块；培养约20天，细胞长至80％融合，经胰酶消化收集细胞，得到间充质干细胞。

9.按权利要求1-8中任意一项所述的干细胞外泌体在治疗血管损伤的修复药物中的用途。