[发明专利]重组载体、菌株、水稻纹枯病菌效应蛋白的表达纯化方法

说明书

本发明公开了一种重组载体、菌株、水稻纹枯病菌效应蛋白的表达纯化方法，属于生物技术领域。该重组载体用于表达水稻纹枯病菌效应蛋白；所述的重组载体是通过将水稻纹枯病菌效应蛋白的编码基因插入到pET‑32a载体的EcoRI与XhoI酶切位点之间得到的；所述水稻纹枯病菌效应蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述水稻纹枯病菌效应蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明通过将带有重组载体的菌株进行活化培养后，再添加异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导目的蛋白表达，然后通过使用蛋白溶解缓冲液溶解目的蛋白后，再通过不同的缓冲液进行多次洗脱以及透析处理后，便可获得浓度较高的水稻纹枯病菌效应蛋白溶液。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种重组载体、菌株、水稻纹枯病菌效应蛋白的表达纯化方法。

背景技术

体外原核表达蛋白，对于研究该蛋白的生物学功能、晶体结构等具有重要意义。然而，在大肠杆菌中表达的蛋白常常由于稀有密码子限制、二硫键形成受阻等因素，造成蛋白不表达或不可溶。

目前，水稻纹枯病菌效应蛋白AGLIP1已被证实并报道其能提高植物抗病性。但是，如何将水稻纹枯病菌效应蛋白在大肠杆菌中以可溶性蛋白的形式进行表达纯化是本领域的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组载体，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种重组载体，所述的重组载体用于表达水稻纹枯病菌效应蛋白；所述的重组载体是通过将水稻纹枯病菌效应蛋白的编码基因插入到pET-32a载体的EcoRI与XhoI酶切位点之间得到的；所述水稻纹枯病菌效应蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述水稻纹枯病菌效应蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种包含上述重组载体的菌株。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述的菌株为大肠杆菌BL21。该包含上述重组载体的菌株的保藏编号KKA5F62019，其于2019年3月12日保藏到沈阳农业大学植物保护学院水稻病害研究室，保藏地址：辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号。

本发明实施例的另一目的在于提供一种水稻纹枯病菌效应蛋白的表达纯化方法，其包括以下步骤：

将上述的菌株置于加有抗生素的培养基中进行活化培养，得到培养液；

将上述培养液继续置于加有抗生素的培养基中进行扩大培养至OD600为0.4～0.8后，再添加诱导剂进行诱导表达，得到诱导菌液；

将上述诱导菌液进行离心分离，弃上清，并用蛋白溶解缓冲液进行重悬和破碎处理后，再进行离心分离，取上清，得到蛋白抽提液，备用；

在纯化柱中加入Ni-NTA悬浮液，接着用第一缓冲液冲洗纯化柱后，再加入上述蛋白抽提液；待蛋白抽提液流到柱床上沿以下时，继续加入第一缓冲液冲洗纯化柱；待第一缓冲液流到柱床上沿以下时，加入第二缓冲液冲洗纯化柱；待柱床中的第二缓冲液流尽时，加入第三缓冲液进行洗脱，得到目的蛋白溶液；

用磷酸缓冲盐溶液对上述目的蛋白溶液进行透析处理，得到水稻纹枯病菌效应蛋白溶液。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的步骤中，培养基为LB培养基，抗生素为氨苄青霉素。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的步骤中，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述的步骤中，每升蛋白溶解缓冲液包括以下组分：NaH₂PO₄·2H₂O 6～8g、17.54g的NaCl 16～19g、咪唑0.5～0.8g。