[发明专利]用于检测鲁氏耶尔森菌的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测鲁氏耶尔森菌的TaqMan探针定量检测方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分鲁氏耶尔森菌与其它种属的菌种，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测鲁氏耶尔森菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对鲁氏耶尔森菌进行TaqMan探针定量检测的方法及相应的检测试剂盒。

背景技术

鲁氏耶尔森菌(Yersinia ruckeri)属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、耶尔森菌属(Yersinia)。是鲑科鱼类红嘴病(redmouth)与称肠炎红嘴病(enteric redmouth,ERM)的病原菌。此病最早于1952年在美国发现，现在已流行于澳大利亚、南非和西欧等地。

该菌为革兰氏染色阴性短杆状、两端圆、周鞭毛、大小为0.7～0.8umX1.3-2.7um，老龄培养物可见长丝状菌体。无芽孢、荚膜。20℃-25℃培养有动力、37℃培养无动力。菌落于37℃培养24h，直径小于1mm。在营养琼脂、TSA、FA和麦康凯琼脂上均生长良好。菌落为圆形、微隆起、淡黄色、光滑、边缘整齐。少数菌株在麦康凯琼脂上生长迟缓或不生长。液体培养物呈均匀混浊。最适生长温度为22-25℃。

耶尔森氏菌的最显著的特性是它们具有抵抗巨噬细胞杀伤作用的能力，可在巨噬细胞内存活和繁殖。鲁克尔耶氏菌是专性寄生菌，虽能在沉积物中存活一段时间，但主要在鲑科鱼体内生存。从明显健康的虹鳟的肾脏和下部肠道、粪便中都可分离到。它也存在于白鲑、江鳕、金鱼等非鲑科鱼体内，甚至陆生动物麝鼠也是本菌的贮藏宿主。

红嘴病主要发生在虹鳟、大西洋鲑、银大麻哈鱼、克氏鲑和大鳞大马哈鱼，为亚急性和急性全身性传染病。在水温15℃时，潜伏期为5～10d。主要特征是皮下出血，使嘴和鳃盖骨发红，因而称之为红嘴病。此外，上下颌和腭部发炎糜烂，腹鳍、肠道和肌肉也往往出血，因此又称之为肠炎红嘴病。细菌同时也侵入其他脏器，引起炎症。对鲑鳟鱼养殖业可造成严重损失。

感染耶尔森氏菌后，目前没有有效的方法进行治疗，只能通过加强疫病监测与检疫，达到防控该病爆发的概率。国内外学者通过大量的研究，建立了一系列针对耶尔森氏菌的检测方法，如组织病理解剖法、电镜观察法、雷氏液体巯基乙酸盐培养法、PCR检测法及LAMP法。但是前三类方法操作复杂、耗时长及检测灵敏度低，只能对发病明显的虹鳟进行诊断；PCR检测法虽然结果准确，但检测时间长、操作复杂、无法定量，很难在生产用进行推广应用；LAMP法虽然检测时间快但假阳性高，达不到精确检测的要求。

本发明提供了一种能够定量、快速、实时监测耶尔森氏菌的方法，以克服现有技术的不足，使耶尔森氏菌的检测更准确、灵敏、快速和方便。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测鲁氏耶尔森菌的TaqMan探针定量检测方法，所述方法能够定量、快速、实时检测鲁氏耶尔森菌，使鲁氏耶尔森菌的检测更准确、灵敏、快速和安全。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、利用TaqMan探针定量检测检测鲁氏耶尔森菌特异性基因16SrRNA基因、rupA基因、yrp1基因；

S4、读取扩增Ct值；当所述鲁氏耶尔森菌特异性基因中至少1个基因的Ct值小于35时，鲁氏耶尔森菌的检测结果为阳性；当所述鲁氏耶尔森菌特异性基因16SrRNA基因、rupA基因、yrp1基因的Ct值均大于35时，鲁氏耶尔森菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述步骤S2中还包括设计16SrRNA基因、rupA基因、yrp1基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。