[发明专利]非洲猪瘟CTL表位多肽及其应用

说明书

本发明提供非洲猪瘟CTL表位多肽及其应用，属于多肽疫苗制备技术领域。本发明通过生物信息学方法及鉴定MHC I结合基序的方法筛选来源于非洲猪瘟病毒(ASFV)中MHC I能够稳定结合的多肽，筛选得到的多肽具有能够启动CD8⁺T细胞产生免疫应答，并刺激机体特异性产生CTL的能力，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑18任一所示。本发明提供的多肽可用于制备非洲猪瘟特异性抗原表位疫苗或多肽疫苗，安全性高，特异性好，在非洲猪瘟的防控工作中具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于多肽疫苗制备技术领域，具体涉及非洲猪瘟CTL表位多肽及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus, ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起的一种急性、出血性、烈性传染病。其特征是发病过程短，一般为5-14天，最急性和急性感染死亡率高达100％。非洲猪瘟是由双链DNA病毒引起，是非洲猪瘟病毒科的唯一成员。血清型是基于红细胞吸附抑制试验(HAI)进行分类，可将32个ASFV毒株分为8个血清组；基因型是根据编码VP-72 蛋白的单一基因序列确定，共分为24个基因型。不同毒株间基因组大小不同，在170-190kb 之间，共编码约150-167个蛋白，包括病毒复制所需蛋白、结构蛋白以及抑制和逃逸宿主防御系统的相关蛋白。

目前仍缺乏针对非洲猪瘟的有效防控和治疗措施，主要的手段仍是加强猪场的隔离防控，对于已发病猪采用“拔牙”式处理并彻底消毒。多个国家曾尝试过研发ASFV灭活疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、DNA+蛋白疫苗、活载体疫苗和减毒活疫苗，但由于安全性和保护效力不理想，无法达到理想的安全性和保护效力。

主要组织相容性复合体I(Major histocompatibility complex class I,MHC I)分子介导的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)反应是机体清除体内病变细胞，抵御病毒感染的重要手段。MHC I分子表达在所有的有核细胞及血小板表面，结合并呈递胞内抗原多肽(如被蛋白酶体降解的病毒多肽)，供CD8+T细胞表面的T细胞受体(Tcell receptor, TCR)特异性识别，在共受体分子(CD8分子等)的协同作用下，激活CD8+T细胞特异性杀伤靶细胞。这一过程被称为CTL反应，而MHC I分子所呈递的能够诱导CTL反应的多肽，被称为CTL表位。多年来，已有研究证明ASF无法通过体液免疫达到针对病毒的有效控制，并已有报道CTL是消灭ASFV的必要手段。MHC I分子与多肽表位的结合是启动CTL 反应的先决条件，因此也成为细胞性抗病毒免疫反应研究的基础，为新型多肽表位疫苗的开发提供条件。

发明内容

目前缺乏针对ASF的有效疫苗，本发明的目的是提供具有开发为非洲猪瘟多肽疫苗潜力的非洲猪瘟CTL表位多肽及其应用。

为了达到以上目的，本发明通过生物信息学方法及鉴定MHC I结合基序的方法筛选来源于ASFV中MHC I能够稳定结合的多肽，并基于该潜在的多肽表位研发并鉴定一种新型多肽疫苗，其最大优势在于多肽预测准确性大幅度提高，所研发的新型多肽疫苗安全性高。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，实现对非洲猪瘟CTL表位的筛选与鉴定。非洲猪瘟CTL表位的筛选方法主要包括以下步骤：

(1)针对已有研究，分析比较不同基因型毒株间蛋白差异，对变异较大的蛋白以及结构蛋白进行挑选；

(2)通过生物信息学方法，通过多个猪主要组织相容性复合体I类分子(SLA I)对步骤(1)中蛋白进行表位预测统计，筛选结合能力较强的多肽；

(3)通过生物信息学方法，对步骤(2)中筛选出的多肽进行频率计算，筛选出现频率高于50％的多肽；

(4)体外合成随机肽库，并利用高效液相色谱串联质谱LC-MS/MS技术及蛋白从头测序De Novo Sequencing鉴定分析随机肽库氨基酸分布；