[发明专利]基于多肽组合标志物定量测定的糖尿病诊断试剂盒及其方法

说明书

本发明涉及医学生物检测领域，具体为多肽组合标志物在制备糖尿病诊断试剂或试剂盒中的新用途。本发明提供了一种利用液相色谱‑质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)定量检测血清中内源多肽的方法及试剂盒，通过本发明中的试剂及方法，可以定量测定人血清中内源4个多肽标志物的含量，进而基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量以及确定的截点值，用于糖尿病的预警和/或诊断。本发明的试剂盒和检测方法稳定性好，特异性高，具有临床推广的潜力。

技术领域

本发明涉及医学生物检测技术及代谢性疾病的诊断、预防和治疗领域，具体地说，是基于定量测定人血浆内源多肽的方法及多肽组合标志物在制备糖尿病早期预警和/或诊断的试剂盒和方法。

背景技术

据2017年国际糖尿病联盟数据显示，全球糖尿病患者已有4.15亿，其中2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)占95％以上。预计到2030年，全球糖尿病患病人数将增至5.52亿。糖尿病是继心血管疾病和肿瘤后危害人类健康的第3大疾病。目前，虽然2型糖尿病的诊断标准已明确，具有口服葡萄糖耐量试验(OGTT)等金标准，但因其糖尿病初期无明显症状且潜伏期长，至症状出现或临床确诊后再干预治疗，病情往往已不可逆转，错失去了最佳干预时期，寻找用于早期预警及诊断的生物标志物对于研究糖尿病的病理、分类、早期诊断、延缓及预防糖尿病的发生具有重要意义。

采用多组学技术发现新的诊断标志物是当前研究的热点。多肽在糖尿病的发病过程及干预治疗中具有重要地位，如诸多的多肽药物如胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide 1,GLP-1)类似物、度拉鲁肽(dulaglutide)、脑钠肽(brain natriureticpeptide，BNP)等肽类制剂。多肽可以体现不同生理病理条件下蛋白的合成、加工和降解过程，同时，对基因的表达、物质代谢等过程又有调节作用，因此，采用多肽组学技术发现新型多肽生物标志物用于糖尿病的早期预警/诊断具有巨大潜力。

标志物验证：目前已发现的2型糖尿病潜在生物标志物包括基因变异、RNA转录子、多肽、蛋白质、脂质和小分子代谢产物(支链氨基酸/芳香氨基酸)等，但多为来自并发症样本，如糖尿病肾病，糖尿病伴高血压及高血糖样本,妊娠糖尿病等(中国专利CN106645757A；医学综述,2019,(20),4080-4086；Mol Cell Proteomics，2010，9(10)，2099-2108；中华实用诊断与治疗杂志,2018,32(01),1-4)，一般出现并发症，糖尿病已处于确诊且不可逆转的后期阶段，缺少针对糖尿病本身及用于早期诊断的生物标志物；此外，采用多组学技术筛选出差异标志物后缺少进一步的临床样本验证工作，因此导致临床应用价值有限；或采用ELISA或Western blot验证，实验成本高且通量不足(中国专利CN108957011；色谱，2019，37(8)：853-862；中国全科医学,2014,(21),2524-2527)。

基于以上研究中存在的问题，本发明采用非靶向多肽组学和靶向定量多肽组学结合的方法，该方法具有通量高、数据重复性好、灵敏度高的特点。采用从发现到验证的策略筛选潜在的诊断标志物，从糖尿病前期临床样本(无并发症)中成功筛选并验证人血清中内源多肽的组合标志物，可用于糖尿病的早期预警及/或诊断，该组合标志物的诊断灵敏度和特异性均良好，并制备了一种可用于定量测定目标多肽含量及用于糖尿病早期预警和/或诊断的试剂盒，该试剂盒目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对糖尿病早期预警诊断标志物匮乏及灵敏度低、特异性低等问题，采用非靶向多肽组学发现差异多肽及靶向多肽组学验证的策略，提供一种组合多肽标志物在糖尿病早期预警/诊断中的应用及试剂盒，同时提供了可用于上述组合多肽标志物定量分析检测的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：