[发明专利]一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法

权利要求书

1.一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)首先采用Illumina高通量测序方法分别获得不同时间节点健康对虾和对应时间点病害对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息；

(2)抽取对虾血液测定超氧化物歧化酶浓度判断病害严重程度，即测定对虾血清中超氧化物歧化酶和溶菌酶活性，结合对虾病症和死亡率划分对虾疾病严重程度；

(3)筛选健康对虾生长过程中的虾龄指示菌种，从肠道细菌群落数据中剔除虾龄指示菌种，消除随生长阶段的本底变化；

(4)比较健康对虾和病害对虾肠道细菌组成动态差异，筛选初始健康状态下未定植于对虾肠道，但是随着对虾病害恶化相对丰度呈线性增长且其丰度显著高于对应时间点健康对虾的细菌类群，定义为多致病菌，将多致病菌特征序列通过与病原菌数据库比对确定多致病菌种类；

(5)计算最后一个时间分组的病害组中所有细菌的驱动种生态特征值ΔB和ASCH分值，筛选出ΔB-0.5且ASCH-score1.5的菌种为多致病菌的直接拮抗菌种，定义为益生菌；

其中驱动种生态特征值ΔB的计算方法如下：

其中B _scaled表示某一多致病菌在某一时间点的居中性数值，细菌节点居中性值是指细菌作为两个相互关联菌种的中间“桥梁”作用的次数，数值越大代表越重要；B _min表示该时间点所有样本中该细菌的最小居中性数值；

B _max表示该时间点所有样本中该细菌的最大居中性数值；

B_calculated表示该时间点所有样本中该细菌的居中性平均值；

ΔB＝B_scaled(D)―B_scaled(H)(2)；

B _scaled(H)表示在所有时间分组中，某一多致病菌在初始健康组中的居中性数值；B_scaled(D)表示由初始健康组转变过来的最后时间分组中的病害组中，该细菌在该病害组中的居中性数值；

ASCH分值计算方法如下：

其中ASCH分值，即ASCH^H-D表示对虾样本从健康到病害转变过程中，菌群种间互作关系的共有菌种节点的变化评分数值，其中H表示健康，D病害；

INBA表示多致病菌的高度关联菌种，其定义为利用采集的健康组和病害组细菌相对丰度与多致病菌相对丰度进行皮尔森相关性分析，r0.7且P0.05或r-0.7且P0.05的细菌即为高度关联菌种；

[INBA]^H表示所有时间样本分组中，最后一个时间分组的健康组和病害组菌群种间互作关系中的共有菌种与最后一个时间分组的健康组中高度关联菌种集合的菌种数量；

[INBA]^D表示所有时间样本分组中，最后一个时间分组的健康组和病害组菌群种间互作关系中的共有菌种与最后一个时间分组的病害组中高度关联菌种集合的菌种数量；

[INBA]^H∩[INBA]^D表示[INBA]^H集合和[INBA]^D集合的交集中的菌种数量；[INBA]^H∪[INBA]^D表示[INBA]^H集合和[INBA]^D集合的并集中的菌种数量；[INBA]^D-[INBA]^H表示[INBA]^D集合和[INBA]^H集合的相对补集中的菌种数量，即属于[INBA]^D集合而不属于[INBA]^H集合的菌种数量；

MD in D，Maximum Directivity in D表示最后一个时间分组的病害组中多致病菌的个体数量；

(6)分别计算几种益生菌在最后一时间分组的健康组对虾肠道中的相对丰度比例，将单个益生菌相对丰度占所有益生菌相对丰度之和的比值作为相应益生菌的个体数量百分比，最终确定益生菌的组合和配比。

2.根据权利要求1所述的一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，其特征在于所述的多致病菌的组成如下：管氏弧菌、河流弧菌珊瑚弧菌和珊瑚弧菌。