[发明专利]一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株

说明书

本发明公开了一种能分泌高中活性抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株，属于生物技术领域。从建立的127株杂交瘤细胞库中筛选出一株具有较高中和活性的杂交瘤细胞株3B5，抗原表位在犬瘟热病毒的H蛋白第228～237位氨基酸。单克隆抗体3B5与单克隆抗体1D7和2G3组成的抗体组合治疗剂中和效价为2¹³，比单独使用3B5、1D7、2G3的中和效价提高8‑32倍中和病毒能力，单克隆抗体组合治疗剂的临床应用试验结果比联合使用单克隆抗体1D7和2G3效果从98％提高到100％，治疗周期从4天缩短为2天。可用于犬瘟热(CD)发病动物的临床治疗，降低生产成本，提高治疗效果。

技术领域

本发明公开了一种分泌抗犬瘟热病毒H蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞3B5株，属于生物技术领域。

背景技术

犬瘟热(canine distemper)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、热性和高度接触性传染病，常引起消化道、呼吸道以及神经系统异常等症状，并能引起机体免疫抑制。犬瘟热的自然感染宿主已由传统的犬科、鼬科和浣熊科扩展到所有食肉目动物、偶蹄目猪科、灵长目的称猴属和鳍足目海豹科等多种动物，发病率几乎可达100％，死亡率为80％以上，已成为危害养犬业和经济动物养殖业的重要传染病之一。

CDV属于副粘病毒科，麻疹病毒属，病毒粒子呈圆形或椭圆形，有时也呈长丝状，直径为150～300nm。粒子中心含有宽径约15～17nm螺旋形核衣壳，外面被覆一近似双层轮廓的膜，膜上排列有1.3nm杆状纤突。病毒的基因组为不分节段的负链RNA，全长15,616nt，从它的3′端到5′端依次为3′端前导序列、核衣壳蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、血凝蛋白基因(H)、大蛋白基因(L)和5′端引导序列。P、N、L为髓芯蛋白，与RNA转录和复制有关，N蛋白有包裹及保护内部基因的功能，P蛋白可能有聚合酶功能。M、F、H为包被蛋白，位于N蛋白的外侧，H蛋白以近N末端的疏水区将其嵌在M蛋白上。其中，H基因全长为1947nt，仅含有一个开放型阅读框，其编码的H蛋白是CDV囊膜表面的糖蛋白之一，可与靶细胞表面的受体(如SLAM和nectin-4)相互作用，介导病毒入侵宿主；同时，H蛋白存在着许多中和性抗原表位，是诱导机体产生中和抗体的主要抗原。

目前预防该病使用的疫苗多为弱毒苗，但是许多犬、水貂、狐等养殖场在应用弱毒疫苗后仍会发生本病。分析原因，与母源抗体、疫苗效价、使用方法以及病毒变异有关。用弱毒疫苗免疫动物也未能得到完全保护，有许多免疫动物群体暴发犬瘟热，损失十分惨重。因此对犬瘟热除了积极的预防外，有必要对患病动物进行有效的治疗，将损失降到最小。犬瘟热病毒的高免血清常用于治疗犬瘟热，但制备成本较高，易传播其它病毒，抗体中和效价参差不齐，难以标准化。因此制备特异性好，抗体中和效价高，易于标准化，制备成本低的单克隆抗体是必然选择。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体(毛开云,等.单克隆抗体技术相关专利分析[J].生物产业技术,2012(6):78-86.)。单克隆抗体识别的抗原表位(即抗体结合抗原的氨基酸序列)具有特异性。因此，解析单克隆抗体识别的抗原表位对后续犬瘟热病毒蛋白功能研究以及治疗、诊断检测等方面具有重要意义。

之前，我们筛选到两株分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株和2G3株(一种分泌高中和活性犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞1D7株，国家发明专利申请号：201210081170.8，授权公告号：CN102618503B，授权公告日：2013-06-12；一种中和犬瘟热病毒的单克隆抗体及抗体组合物，国家发明专利申请号：201310036576.9，授权公告号：CN103059133B，授权公告日：2015-12-09。)，用其制备的单克隆抗体1D7或/和2G3均可以中和不同动物源的CDV毒株，抗犬瘟热病毒毒株的范围广泛。