[发明专利]一种单个位点DNA甲基化检测试剂盒

说明书

本发明提供一种单个位点DNA甲基化检测试剂盒，由环介导扩增反应液、DNA聚合酶、引物探针混合液、标准品组成。本发明试剂盒利用特定的引物对盐处理后的样品DNA进行LAMP扩增，通过OSD报告探针链替换反应识别含有甲基化位点的基因的扩增产物，对甲基化水平进行简单、快速、高灵敏度的检测。本发明试剂盒可用于单个位点DNA甲基化检测(选取人基因组SLC22A2基因近端启动子区域中E‑Box位点作为检测目标)。本发明试剂盒是一种样品要求低、检测时间快、诊断费用低、操作简单、适合推广的产品。是目前癌症诊断技术能够取得重大突破的正确方向之一。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及肿瘤等重大疾病血清、尿液等生物样品甲基化检测新技术，尤其涉及基于链替换探针和环介导扩增的DNA甲基化检测试剂盒。能为临床肿瘤等重大疾病早期诊断，提供高灵敏度生物样品标志物辅助判断依据。

背景技术

世界卫生组织(WHO)统计,每年世界上有1000万人患上癌症,而死于癌症的人数约6万,占全球死亡人数的12％。卫生部肿瘤防治办公室提供的我国肿瘤发病率和十大恶性肿瘤发病率排序显示：中国每年癌症新发病例约为220万人，因癌症死亡人数为160万人,平均每3分钟就有1.3人死于癌症,而且癌症的发病率呈急剧上升趋势。肺癌、乳腺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病首位。据《文汇报》报道，在过去不到20年的时间内，我国癌症发病率上升69％，死亡率增长了29.4％，癌症已经成为威胁人类健康的第一杀手。治疗癌症早期诊断是关键。按目前的医疗水平，早期癌症病人约有80％-90％以上可以治愈，治疗后不仅提高了生存率，也提高了病人的生存质量，因此对于癌症早期诊断具有十分重要的意义。

近年来，大量的研究表明甲基化与结直肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、胶质瘤、前列腺癌等多种癌症具有相关性。甲基化水平的异常与细胞恶性转化相关，甲基化参与肿瘤演进。因此，DNA甲基化是癌症研究的重要部分，通过分析甲基化在疾病发生发展中的作用以及与临床病理特征的关系，能在早期预测肿瘤的发生，有效地预测肿瘤的复发和转移，在肿瘤的早期筛查、预防、诊断治疗与预后分析发挥重要作用。

DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化下.DNA中CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性的添加甲基基团的化学修饰现象。DNA甲基化通常发生在基因的5’端启动子和第1外显子“CpG岛”区域，能够引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而抑制基因转录和表达。近来研究发现，DNA甲基化还发生在基因转录起始点上游称为“CpG岛岸”(CpG island shore)的区域，绝大部分组织特异性的DNA甲基化发生在“CpG岛岸”而非“CpG岛”区域，如结肠癌中大部分肿瘤特异的DNA甲基化差异区域分布在“CpG岛岸”。许多基因具有肿瘤特异性的甲基化表型，一方面基因组广泛的低甲基化起原癌基因活化，基因组不稳定性增加；另一方面启动子区的高甲基化，引起抑癌基因及错配修复基因表达沉默，导致肿瘤的发生。研究表明，基因组的低甲基化随着细胞恶性度的增加而愈加明显，是病情诊断的要指标；此外，CpG岛局部的高甲基化发生于细胞恶变之前，能在早期预测肿瘤的发生，其也能有效地预测肿瘤的复发和转移。同时基因的甲基化还可以在体液中检测到，非常适合建立无创检测，应用于肿瘤的鉴别诊断，具有重要意义。

近些年来，DNA甲基化检测方法得到了迅速的发展。研究者对于DNA甲基化的检测方法主要可以分为两个层面：(1)基于全基因组DNA甲基化水平检测；(2)基于片段(位点)DNA甲基化检测。从最初传统的色谱分析技术到后来的测序检测技术以及如今的传感器快速检测技术，其特异性、灵敏度以及高效性逐步提升。但不同的技术有各自优越性，也存在一定的局限性，特别是针对位点DNA甲基化检测，仍存在巨大的挑战。利用各种检测方法检测DNA甲基化对于癌症和疾病的早期诊断具有重要意义。而这也对DNA甲基化检测技术特异性、灵敏度以及高效性提出了更多的要求。

发明内容