[发明专利]一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法及其应用

权利要求书

1.一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法，其特征是该培养方法包括以下步骤：

a1、将电导率为18.2 MΩ•CM的Milli-Q级超纯水在120℃下灭菌20min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；

b1、选取2龄的背角无齿蚌幼蚌，用无菌水洗净贝壳表面的附着物，置于无菌水中暂养24 h；

c1、先向20℃的950ml的无菌水中加入青霉素250000 IU、链霉素0.3g、庆大霉素2.5g和卡那霉素1.5g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒2h；

d1、用无菌的不锈钢剪刀迅速解剖出背角无齿蚌幼蚌的鳃，将其置于经0.22 μm滤头过滤的抗生素溶液中，剪成2 mm²的小片，在20℃条件下，消毒1 h；

e1、消毒后用50 ml无菌离心管收集鳃片，先取鳃片质量10倍、4℃且浓度为0.025wt%的链霉蛋白酶溶液，再取链霉蛋白酶溶液体积30%的步骤c配制的抗生素溶液，将所取的抗生素溶液与链霉蛋白酶溶液混合在一起形成消化溶液，将鳃片置于消化溶液中分解细胞8 h，然后往链霉蛋白酶溶液中加入与其质量相等的胎牛血清终止消化；

f1、先用70μm无菌滤网将背角无齿蚌鳃细胞液过滤至无菌离心管，然后1000 r/min离心5min，去除清液，收集细胞沉淀；

g1、在600 ml无菌水中加入L-15基础培养基200 ml、青霉素30000 IU、链霉素0.03g、庆大霉素0.6 g、卡那霉素0.5 g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸3 g和左旋谷酰胺60 ml，形成细胞培养基混合液，再取细胞培养基混合液体积10%的FBS并加入到细胞培养基混合液中经温度控制形成20℃的人工合成细胞培养基；取部分人工合成细胞培养基加入到步骤f1的离心管中，调节成细胞浓度为5×10⁵ cell/ml的细胞悬液；

h1、在24孔板的每个培养孔洞中加入细胞悬液0.5 ml，培养孔板置于20℃的二氧化碳培养箱中进行细胞原代培养，6 h即可以完成贴壁；每天用浓度为0.4wt%的台盼蓝染色随机检验3个血细胞计数板方格中的细胞成活率，然后用20℃的人工合成细胞培养基更换掉培养孔洞中1/2的人工合成细胞培养基；成功获得了培养时间长达120h、成活率≥90%的背角无齿蚌原代培养鳃细胞。

2.一种背角无齿蚌鳃细胞原代培养方法，其特征是该培养方法包括以下步骤：

a1、将电导率为18.2 MΩ•CM的Milli-Q级超纯水在121℃下灭菌30min，灭菌后冷却至常温，制成无菌水；

b1、选取2龄的背角无齿蚌幼蚌，用无菌水洗净贝壳表面的附着物，置于无菌水中暂养72 h；

c1、先向20℃的950ml的无菌水中加入青霉素250000 IU、链霉素0.3g、庆大霉素2.5g和卡那霉素1.5g配制成抗生素溶液；再将洗净的背角无齿蚌置于抗生素溶液中消毒2h；

d1、用无菌的不锈钢剪刀迅速解剖出背角无齿蚌幼蚌的鳃，将其置于经0.22 μm滤头过滤的抗生素溶液中，剪成1 mm²的小片，在20℃条件下，消毒1 h；

e1、消毒后用50 ml无菌离心管收集鳃片，先取鳃片质量10倍、20℃且浓度为0.1wt%的链霉蛋白酶溶液，再取链霉蛋白酶溶液体积30%的步骤c配制的抗生素溶液，将所取的抗生素溶液与链霉蛋白酶溶液混合在一起形成消化溶液，将鳃片置于消化溶液中分解细胞4 h，然后往链霉蛋白酶溶液中加入与其质量相等的胎牛血清终止消化；

f1、先用60μm无菌滤网将背角无齿蚌鳃细胞液过滤至无菌离心管，然后1500 r/min离心5min，去除清液，收集细胞沉淀；

g1、在600 ml无菌水中加入L-15基础培养基150 ml、青霉素30000 IU、链霉素0.03g、庆大霉素0.6 g、卡那霉素0.5 g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸3 g和左旋谷酰胺60 ml，形成细胞培养基混合液，再取细胞培养基混合液体积20%的FBS并加入到细胞培养基混合液中经温度控制形成20℃的人工合成细胞培养基；取部分人工合成细胞培养基加入到步骤f1的离心管中，调节成细胞浓度为10⁶ cell/ml的细胞悬液；

h1、在24孔板的每个培养孔洞中加入细胞悬液0.5 ml，培养孔板置于20℃的二氧化碳培养箱中进行细胞原代培养，6 h即可以完成贴壁；每天用浓度为0.4wt%的台盼蓝染色随机检验3个血细胞计数板方格中的细胞成活率，然后用20℃的人工合成细胞培养基更换掉培养孔洞中80%的人工合成细胞培养基；成功获得了培养时间长达120h、成活率≥90%的背角无齿蚌原代培养鳃细胞。