[发明专利]一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，负载免疫调节剂的肿瘤细胞微囊泡，通过微囊泡表面连接负载佐剂的脂质体稳定形成抗肿瘤疫苗，具体包括以下步骤：

1）、制备负载免疫调节剂的肿瘤细胞微囊泡：

（1）、将肿瘤细胞于含10%胎牛血清的RIPM1640培养基中，置于37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱中培养；

所述的肿瘤细胞为卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌或黑色素瘤细胞的一种或多种；

（2）、将免疫调节剂与含胎牛血清的RIPM1640培养基混合后加入到贴壁生长的肿瘤细胞中，并紫外照射肿瘤细胞60min使其发生凋亡；

所述的免疫调节剂为治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌或黑色素瘤的免疫调节剂中的一种或多种；

（3）、继续置于37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱中孵育肿瘤细胞12-24h，收集步骤中（2）处理细胞后的培养基上清，用差速离心的方法收集得到负载免疫调节剂的肿瘤微囊泡；

（4）、用100-500微升的无菌生理盐水重悬1×10⁶-1×10⁷个肿瘤细胞来源的微囊泡，-80℃保存；

2）、制备负载佐剂的脂质体；

（1）、将2-3毫克 (2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺 （DOTAP）、6-7毫克二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）和1-2毫克二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal）溶解于15ml氯仿并超声15min；

（2）、旋蒸至氯仿全无后，加入1-2毫升含2-4OD佐剂的pH为7.4磷酸缓冲盐溶液，在37℃条件下继续孵育1h形成脂质体膜；

所述的佐剂为铝盐、蛋白类、核酸类佐剂CpG-ODN、含脂类、混合类佐剂；

（3）、收集脂质体膜后，以200W功率碳超15次，每次碳超3s，得负载佐剂的脂质体；

3）、微囊泡捕获脂质体制备抗肿瘤疫苗：

（1）、将50μg的肿瘤微囊泡，其中负载免疫调节剂250μg，与负载0.3μg 佐剂的脂质体在4℃下孵育12h；

（2）、4℃，14000g离心60min收集沉淀，得微囊泡与脂质体结合的抗肿瘤疫苗。

2.根据权利要求1所述的基于细胞微囊泡的抗肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、制备负载免疫调节剂纳米四氧化三铁的鼠源B16F10黑色素瘤细胞微囊泡：

（1）、将鼠源B16F10黑色素瘤细胞于含10%胎牛血清的RIPM1640培养基中，置于37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱中培养；

（2）、用免疫调节剂纳米四氧化三铁与含胎牛血清的RIPM1640培养基混合后加入到贴壁生长的鼠源B16F10黑色素瘤细胞中，并紫外照射鼠源B16F10黑色素瘤细胞60min使其发生凋亡；

（3）、继续置于37℃、饱和湿度、5%CO₂培养箱中孵育鼠源B16F10黑色素瘤细胞16h，收集步骤中（2）处理细胞后的培养基上清，用差速离心的方法收集得到负载免疫调节剂纳米四氧化三铁的肿瘤微囊泡；

（4）、用100微升的无菌生理盐水重悬5×10⁶个肿瘤细胞来源的微囊泡，-80℃保存；

2）、制备负载佐剂CpG-ODN的脂质体；

（1）、将2.2毫克(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺 （DOTAP）、6.6毫克二油酰基磷脂酰乙醇胺（DOPE）和1.2毫克二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal）溶解于15ml氯仿并超声15min；

（2）、旋蒸至氯仿全无后，加入1毫升含2OD CpG-ODN佐剂的pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液，37℃条件下继续孵育1 h形成脂质体膜；

（3）、收集脂质体膜后，以200W功率碳超15次，每次碳超3s，得负载佐剂CpG-ODN的脂质体；

3）、微囊泡捕获脂质体制备抗肿瘤疫苗：

（1）、将50μg的肿瘤微囊泡，其中负载纳米四氧化三铁250μg，与负载0.3μg 佐剂CpG-ODN的脂质体在4℃下孵育12h；

（2）、4℃，14000g离心60min收集沉淀，得微囊泡与脂质体结合的抗肿瘤疫苗。