[发明专利]影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法

权利要求书

1.影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、从NCBI数据库获得汉滩病毒HTNV的包膜糖蛋白GP的氨基酸序列，并将GP基因序列克隆入pCDNA3.1载体中，在此基础上，利用点突变技术将克隆GP基因序列的Gn蛋白胞质尾区构成口袋结构的四个氨基酸的核酸序列依次突变为丙氨酸，同时将这四个氨基酸替换为经典的类似基质蛋白的晚期结构域L-domain，获得四种含有突变糖蛋白基因的质粒；

其中所述构成口袋结构的四个氨基酸序列为⁶¹⁵Tyr-Arg-Thr-Leu⁶¹⁸；

步骤2、将293T细胞用消化传代得到传代细胞，向所述传代细胞分别转染四种含有突变糖蛋白基因的质粒，对转染后的传代细胞进行培养，分别获得其细胞样品和上清样品；

步骤3、将各细胞样品加入上样缓冲液Western blotsample buffer煮沸，冷却至室温后进行电泳，再转至PVDF膜上，PVDF膜以封闭液室温封闭后加入HTNV Gn特异性单克隆抗体孵育过夜，得到一次孵育细胞样品，通过TBST缓冲液将所述一次孵育细胞样品中的多余抗体洗去，再加入红外标记的抗小鼠二抗，室温孵育，然后再通过TBST缓冲液洗去未结合的二抗，得到二次孵育细胞样品，将所述上清样品按照本步骤上述操作得到二次孵育上清样品；

步骤4、使用红外成像仪扫描所有的所述二次孵育细胞样品和二次孵育上清样品，若同一氨基酸对应的二次孵育细胞样品和二次孵育上清样品中均能检测到Gn蛋白，则该氨基酸对HTNV病毒出胞无影响，否则该氨基酸的突变将影响HTNV病毒出胞，限制病毒释放；影响HTNV病毒出胞的氨基酸序列即为影响HTNV GP胞质尾区的出胞表位序列。

2.根据权利要求1所述的影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法，其特征在于，所述步骤1中利用点突变技术将克隆GP基因序列的Gn蛋白胞质尾区构成口袋结构的四个氨基酸的核酸序列依次突变为丙氨酸具体为，利用QuikChange Site-DirectedMutagenesis Kit试剂盒将克隆GP基因序列的Gn蛋白胞质尾区由酪氨酸Y-精氨酸R-苏氨酸T-亮氨酸L构成口袋结构的四个氨基酸的核酸序列分别依次突变为丙氨酸ACG的序列：Y615A、R616A、T617A和L618A。

3.根据权利要求1所述的影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法，其特征在于，所述步骤2具体按照以下步骤实施：

步骤2.1、将293T细胞用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶-EDTA分别消化后传代四个至25cm²底面细胞培养瓶中，待传代细胞密度达到60％时分别转染各含有突变糖蛋白基因的质粒6h，得到四种转染后细胞；

步骤2.2、将放置各转染后细胞的细胞培养瓶更换为无血清专用培养基，使所述无血清专用培养基置于37℃条件下的CO₂细胞培养箱中，培养24h后收集无血清专用培养基中的细胞上清和细胞；

步骤2.3、将收集的所述细胞上清以1000rpm离心10min，得到一次上清，再取一次上清的上清以4000rpm离心20min得到二次上清，对所述二次上清重复本步骤上述操作，得到四次上清，使用超滤管对所述四次上清进行超滤，取超滤后的截留液作为上清样品；

步骤2.4、向收集的所述细胞中加入PBS缓冲液，经-80℃/37℃反复冻融三次后得到冻融细胞液，将所述冻融细胞液以10000rpm离心20min后取其上清作为细胞样品。

4.根据权利要求3所述的影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法，其特征在于，所述步骤2.3中所使用的超滤管的截留分子量为3000Da。

5.根据权利要求1所述的影响HTNV Gn胞质尾区的出胞表位序列的筛选及鉴定方法，其特征在于，所述步骤3具体按照以下步骤实施：

步骤3.1、将各细胞样品加入Western blotsample buffer后煮沸5min，冷却至室温后以质量浓度为12％的聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE、160V电压进行电泳50min，随后以100V恒压电转至PVDF膜上；

步骤3.2、PVDF膜以质量浓度为5％的BSA牛血清白蛋白封闭液室温封闭1h后，加入HTNVGn特异性单克隆抗体在4℃条件下孵育6～8h，得到一次孵育细胞样品；

步骤3.3、通过TBST缓冲液洗去一次孵育细胞样品的多余抗体，再加入红外标记的抗小鼠二抗，室温孵育2h后再通过TBST缓冲液洗去多余抗体，得到二次孵育细胞样品；

将上清样品按照步骤3.1～步骤3.3上述操作得到二次孵育上清样品。