[发明专利]一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针、试剂盒以及检测方法

权利要求书

1.一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针，其特征在于：包括引物组和探针Probe；所述引物组包括正向引物RPA-F和反向引物RPA-R；

正向引物RPA-F序列：

5’-ATTCTRATGATAAATGGCACTCCACTTCCGGC-3’；

反向引物RPA-R序列：

5’-CCTACTCGTCAAACGTTTGTTCTGGCCCTAGCTT-3’；

探针Probe的核苷酸序列由两部分连接而成，分别为第一部分和第二部分，其中第一部分的核苷酸序列为：

第一部分的序列：

5’-AATGAWCAAACGAGTCCTCCCGCCTCAGGAA-3’；

第二部分的序列：

5’-AACAAGTGAAACACCTAA-3’；

第一部分的5’端连接羧基荧光素，第二部分的3’端连接磷酸，第一部分的3’端和第二部分的5’端之间通过四氢呋喃连接。

2.根据权利要求1所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的引物组和探针，其特征在于：反向引物RPA-R序列的5’端用生物素修饰；引物组和探针Probe的总扩增产物大小为267bp。

3.一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的引物组和探针。

4.一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：包括步骤：

合成以下引物组和探针；

正向引物RPA-F序列：

5’-ATTCTRATGATAAATGGCACTCCACTTCCGGC-3’；

反向引物RPA-R序列：

5’-CCTACTCGTCAAACGTTTGTTCTGGCCCTAGCTT-3’；

探针Probe序列：

5’-FAM-AATGAWCAAACGAGTCCTCCCGCCTCAGGAA[THF]AACAAGTGAAACACCTAA-P-3’；

RPA-LFD检测方法的建立；

将正向引物、反向引物和探针加入到离心管中，再加入无引物再水合缓冲液，振荡并离心；将模板和灭菌水混匀后，放入上述离心管中，振荡并离心，此时的溶液为再水合溶液；将再水合溶液转移至反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，然后加入醋酸镁，充分混匀，进行RPA-LFD反应恒温孵育后，得到反应产物；

将反应产物与PBST电泳缓冲液混合后得到稀释样本，将稀释样本转移至侧向流纸条的样本垫，然后将所述样本垫放入电泳缓冲液中，观察结果；若所述样本垫出现两条带为阳性；若所述样本垫只在对照线出有一条带为阴性。

5.根据权利要求4所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述检测方法的反应总体系为50μL；其中浓度为10μM的正向引物RPA-F为2.1μL，浓度为10μM的反向引物RPA-R为2.1μL，浓度为10μM的探针Probe为0.6μL，无引物再水合缓冲液为29.5μL，模板1μL，无菌水为12.2μL，浓度为280mM的醋酸镁为2.5μL。

6.根据权利要求5所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述恒温孵育的时间为15min。

7.根据权利要求6所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述恒温孵育的温度为36℃。

8.根据权利要求7所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述稀释样本是通过将2μL的反应产物与98μL的PBST电泳缓冲液混合得到的。

9.根据权利要求8所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：所述样本垫上的稀释样本体积为10μL。

10.根据权利要求9所述的一种基于RPA方法快速检测非洲猪瘟病毒的检测方法，其特征在于：放入样本垫的电泳缓冲液的体积为200μL。