[发明专利]一种高纯种超微藻的分离和鉴定方法

说明书

本发明公开了一种高纯种超微藻的分离和鉴定方法，本方法将流式细胞仪以及分子生物学技术集成协同运用，先采用流式细胞仪分选出特定的超微藻类群，而后进行单细胞孔板培养，扩大培养后采用高通量测序技术进行藻类鉴定即可。此法可高效、快速地分离培养出纯种超微藻，为湖泊水体超微藻的分离培养提供了成套技术，从而为我国藻种库的扩种提供了一部分的理论技术支持。

技术领域

本发明属于环境科学、生态学领域的藻类分离培养技术领域，具体涉及一种快速分离纯种超微藻的方法。

背景技术

超微藻群体庞大，生境广泛，普遍分布于各大海洋和湖泊生态系统中，其个体小、比表面积大的优势使其能高效的获取、利用资源进行生长繁殖，因而对湖泊初级生产力有重要的贡献，其全年平均贡献率随着湖泊营养盐水平的上升而下降，相关研究表面在抚仙湖、鄱阳湖和巢湖其贡献率分别达到65%，60%和23%。超微藻作为微食物环的一个初始的关键环节，可被一些异养鞭毛虫和纤毛虫摄食，进而成为大型浮游生物的间接食物，由此进入经典食物网，最终影响水产渔业的产量。研究表明超微藻对水体的碳代谢平衡也具有重要影响，在推动水生态系统的物质循环及能量流动中意义重大。也因超微藻个体微小，缺乏显著的形态学分类标准，光学显微镜甚至电子显微镜也很难进行种类鉴定，以至于超微藻纲鲜少有新物种被报道，大大降低了人们对超微藻的认知，从而忽略了这一组成繁多而又不容小觑的生物资源。因此若有一种能快速分离培养和鉴定超微藻的方法，能大大提高对超微藻的认知，从而了解超微藻在生态系统中的作用，为进一步探索我国自然资源奠定了基础。

发明内容

发明目的：针对上述现有存在的问题和不足，本发明的目的是提供了一种高纯种超微藻的分离和鉴定方法，将流式细胞仪以及分子生物学技术集成协同运用，高效快速地分离培养出纯种超微藻，为湖泊、海洋等水体超微藻的分离培养提供了成套技术，大大提高人们对超微藻的认知，从而了解超微藻在生态系统中的作用，为进一步探索我国自然资源奠定了基础。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一种高纯种超微藻的分离和鉴定方法，包括以下步骤：

（1）首先，在目标水体多次采集水样并进行混合，并用300目的筛绢进行预过滤；

（2）然后，选择激发波长分别为488nm和640nm的荧光作为叶绿素荧光，并在200-300个细胞/秒的进样流速下，通过流式细胞仪对水样的目标藻细胞数进行分选，分选过程中设置侧向散射光，以3.1μm 的nile小球圈定3μm以内区域，收集适量目标超微藻细胞的藻样；

（3）接着，采用过滤后的湖水对分选得到的目标超微藻细胞的藻样进行稀释至1cell·100μL^-1；

（4）经过稀释后的藻细胞稀释溶液与20%的GB11培养液混合分装于孔板中，置于培养箱进行培养；

（5）将步骤（4）中发生变色的藻细胞液取出，转移至含有BG11培养液的无菌瓶中进行扩大培养数日；扩大培养成功的藻液通过离心弃上清液后收集至EP收集管内；

（6）对步骤（5）收集的藻样提取DNA，并通过分子生物学技术进行藻种鉴定。

进一步的，步骤（1）中水样是通过采集目标水体水面以下0. 5m内的表层水、中层水和离湖底0. 5m以内的湖底水的三层水混合而得。

进一步的，步骤（3）中用于稀释的湖水通过0.2μm聚碳酸脂滤膜进行过滤。

进一步的，步骤（4）的培养条件：每日光照周期为16小时光照与8小时黑暗，培养温度为25±1℃，且每3日补充一次过滤后的湖水至原体积。

进一步的，步骤（6）中的藻样通过DNeasy Blood & Tissue Kit 试剂盒提取DNA；