[发明专利]一种用于多种血栓标志物检测的蛋白芯片及其制备方法

说明书

本发明公开了一种用于多种血栓标志物联合检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：(1)黑玻片预处理；(2)抗体溶液点样；(3)封闭工艺；制得所述蛋白芯片。本发明的蛋白芯片用于检测多种血栓标志物浓度，防范和降低血栓风险，指导血栓治疗。本发明产品是同时包含有TAT（凝血酶‑抗凝血酶复合物）、PIC（纤溶酶‑α2抗纤溶酶复合物）、tPAIC（组织型纤溶酶原激活物‑纤溶酶原激活抑制复合物）、TM（血栓调节蛋白）、FDP（纤维蛋白原降解产物）和DD（D‑二聚体）6个指标的蛋白芯片诊断试剂盒。不仅是首次使用蛋白芯片技术检测这些指标，更具有快速、高效、简便、低成本等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测多种血栓标志物的蛋白芯片及其制备方法。

背景技术

凝血七项以及凝血因子筛查基本属于血栓形成后的被动检测，对于血栓形成前却并不敏感。相比于发现血栓后的溶栓治疗，在血栓形成前及时发现血栓风险，并及时采取措施显得尤为重要。针对血栓形成之前和血栓形成早期的临床诊断问题，日本希森美康公司首次提出新血栓四项(TAT，TM，PIC，tPAIC)，再加上纤溶系统的FDP和DD两个指标的联合检测，可以对血栓起到早发现、早治疗的作用。

目前新血栓四项标志物的检测手段十分有限。虽然少数公司开发了磁珠法化学发光免疫产品，但是存在价格昂贵，效率不高，多个指标检测需要各自独立的定标和质控，操作繁琐。而且由于FDP和DD需要用另外的血凝仪器测定，并不利于血栓病人快速、及时、频繁的临床监测和监测。

利用三联生物已有的硬基质蛋白芯片检测平台，将血栓新四项、FDP、DD等指标的检测集成到一张蛋白芯片上，开发了多种血栓标志物检测芯片，可以在血栓形成的早期进行有效诊断，并且辅助监测抗血栓药物的治疗效果。相对于已有产品，蛋白芯片联检在提高效率、降低成本、简便操作等方面具有明显的优势。

(1)TAT(凝血酶-抗凝血酶复合物)

凝血酶(thrombin)是一种多功能丝氨酸蛋白水解酶，具有与胰凝乳蛋白酶相似的序列与结构。它含A、B两条多肽链，由一个链间二硫键相连。β链为功能链，具有典型的丝氨酸蛋白水解酶折叠结构，含有1个位于两个β折叠桶之间的活性中心，2个外结合位点，1个Na离子结合位点，一个自我催化水解环以及一个W60d环。凝血酶具有Na离子诱导的变构酶特性，在血液中有Na离子结合型和Na离子解离型两种构象。这两种构象是可以相互转化的，其相互转化的部分机理是由于效应因子或底物结合到凝血酶的特定位点而引起构象发生变化和能量转移，从而改变了Na离子结合与解离的平衡状态^[1]。

凝血酶直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。而且还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管、实质性脏器的出血及其他各种出血。还具有激活受体，产生细胞生物学效应，如诱发炎症、诱导细胞释放细胞因子、引起细胞增殖、组织器官再生等。中枢神经系统的凝血酶还具有神经毒性，会引起脑细胞损伤。

凝血酶半衰期较短，很难检测到，因此可以检测凝血酶与抗凝血酶所形成的复合物。升高说明与DIC，DVT，PE以及心房颤动等其他凝血系统激活状态有关^[2]。

(2)PIC(纤溶酶-α2抗纤溶酶复合物)

纤溶酶原是纤溶酶的非活性形式，主要在肝脏中合成，主要的器官和组织也会表达。在生理状态下，纤溶酶原通过活性环剪切后转化成纤溶酶。活化的纤溶酶具有广泛的底物特性，包括纤维蛋白、纤维蛋白原、补体成分3、补体成分5等。纤溶酶也可以靶向关键的凝血酶原激活剂tPA和uPA，从而产生正反馈环。有活性的纤溶酶在纤溶和止血、细胞外基质降解、细胞迁移、组织重塑、伤口愈合、血管生成、炎症和肿瘤细胞迁移等生理和病理过程中具有重要作用。