[发明专利]一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法

权利要求书

1.一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）扩增基因片段

选用克罗诺杆菌特异性gluA基因，所述gluA基因为克罗诺杆菌α-葡萄糖苷酶基因；

用一对扩增引物F:5’- AGGGATCCTGAAAGCAATCGACAAGAA -3’；

R：5’- CCGAAGCTTACTCATTACCCCTCCTGATG -3’；

对克罗诺杆菌特异性gluA基因扩增，得到克罗诺菌属六种不同菌的gluA基因片段，

（2）酶切扩增产物

采用RsaI限制性内切酶对扩增得到的六种不同菌的gluA基因片段的扩增产物分别进行酶切，获得克罗诺菌属六种不同菌的差异性PCR-RFLP指纹图谱，克罗诺菌属六种不同菌分别为：1.阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii），2.苏黎世克罗诺杆菌（Cronobacterturicensis）；3莫金斯克罗诺杆菌（Cronobacter muytjensii），4.柏林克罗诺杆菌（Cronobacter dublinnensis），5.丙二酸盐克罗诺杆菌（Cronobacter malonaticus），6.康帝蒙提克罗诺杆菌（Cronobacter condimenti）。

2.根据权利要求1所述的一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法，其特征在于：步骤（1）的具体操作如下：

克罗诺杆菌特异性gluA基因扩增片段大小为1680 bp，扩增条件是：PCR扩增在PCR仪上进行，反应体系：终浓度为10 mmol/L引物0.25-1.0 µL，DNA模板4-10 ng，15-30mmol/LTris-HCl、60-120 mmol/L KCl、2.0-3.0 mmol/L MgCl₂，加无菌双蒸水至50 µL；反应条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，54-58℃退火45-60 s，72℃延伸50-60 s，30个循环；72℃10 min。

3.根据权利要求1所述的一种基于RsaI单酶切gluA基因区分克罗诺杆菌属不同种的分子分型方法，其特征在于：步骤（2）中，酶切条件：gluA基因PCR 扩增产物10-15 µL，无核酸酶无菌水10-15 µL，1×buffer 2.5 µL：33 mM Tris-acetate，10 mM magnesium acetate，66 mM potassium acetate，0.1mg/ml BSA； RsaI限制性内切酶1-2µL, 37℃ 孵育0.5-3.0h。