[发明专利]一种间充质干细胞分泌因子的制备及应用

权利要求书

1.一种间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1） 选用多能诱导干细胞，加入间充质干细胞完全培养基进行分化，12-16天后对细胞进行分选，得到CD105阳性的细胞群，使用间充质干细胞完全培养基对获得的阳性细胞进行扩增；

2）扩增至P4代次时对所得到的间充质干细胞进行表面标志物的鉴定，筛选具有间充质干细胞特征的细胞进行后续培养；

3）继续培养至P5、P6、P7或P8代，当细胞汇合度为60%-70%时，吸去所述间充质干细胞完全培养基，使用平衡液润洗后，加入低糖DMEM；

4）继续培养12-36小时后，收集细胞培养上清液，所述上清液经离心去除细胞碎片和杂质后过滤，即得包含所述间充质干细胞分泌因子的溶液，所述间充质干细胞特征为CD11、CD34、CD45表达阳性率在0~2%区间内，CD73、CD90、CD105表达阳性率在90%~100%区间内。

2.如权利要求1所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

对步骤1）- 4）制备的间充质干细胞分泌因子进行支原体及内毒素检测，当结果为阴性时将制得的间充质干细胞分泌因子分装后冷冻保存。

3. 如权利要求1所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，所述的间充质干细胞完全培养基为低糖DMEM培养基，并且进一步包含10% 胎牛血清、100 units/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、2mM GlutaMAX、非必需氨基酸以及55μM β巯基乙醇。

4.如权利要求3所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞完全培养基还包含EGF和FGF，所述的EGF及FGF的浓度范围为2ng/mL-5ng/mL。

5.如权利要求1所述的间充质干细胞分泌因子的制备方法，其特征在于，所述低糖DMEM为无酚红低糖DMEM。