[发明专利]荧光亮度宽幅变化的环磷酸腺苷荧光探针

说明书

本发明涉及一种荧光亮度宽幅变化的环磷酸腺苷荧光探针，其具有如式I所示结构：MlotiK1 CNBD‑N‑linker1‑cpEGFP‑linker2‑MlotiK1 CNBD‑C 式I，其中，MlotiK1 CNBD‑N为MlotiK1 CNBD的N端，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述MlotiK1 CNBD‑C为MlotiK1 CNBD的C端，具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；cpEGFP具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。linker1为WG，linker2为RV。本发明的荧光探针荧光亮度宽幅变化大，对于提高探测灵敏度具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及cAMP荧光探针及其应用。

背景技术

环磷酸腺苷(cAMP)是目前最大药物靶标G蛋白偶联受体(GPCR)家族的下游信使分子，cAMP荧光探针及显微成像研究是GPCR信号通路的基础研究和药物开发的重要研究方向。cAMP荧光探针主要分为基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针及基于单个荧光蛋白的探针，后者动态范围较前者大且使用简单。目前基于单个荧光蛋白的cAMP探针分为绿色和红色2小类，前者主要有Flamindo2[1]、cADDis[2]及cAMPr[3]，后者主要有Pink Flamindo[4]、Red cADDis[5]及R-FlincA[6]。实际应用中，动态范围(荧光亮度变化幅度,ΔF/F₀)是很重要的参数，与检测灵敏度直接相关。在37℃生理温度培养细胞中，上述探针动态范围均较小。综上，提高探针在实际应用中的动态范围，对于提高探测灵敏度具有重要意义。

活细胞中cAMP荧光成像是指将cAMP荧光探针表达在细胞中，然后利用荧光显微镜检测探针荧光的强度变化。荧光探针是cAMP荧光成像分析的关键。现有的基于单个荧光蛋白的cAMP探针及动态范围如下表所示，#252是本发明人2018申请专利设计到的探针。从该表可知，37℃生理温度培养细胞中。

参考文献：

1.Odaka H,Arai S,Inoue T,Kitaguchi T(2014)Genetically-encoded yellowfluorescent cAMP indicator with an expanded dynamic range for dual-colorimaging.PLoS One 9:e100252.

2.Tewson PH,Martinka S,Shaner NC,Hughes TE,Quinn AM(2016)New DAG andcAMP Sensors Optimized for Live-Cell Assays in Automated Laboratories.JBiomol Screen 21:298-305.

3.Hackley CR,Mazzoni EO,Blau J(2018)cAMPr:A single-wavelengthfluorescent sensor for cyclic AMP.Sci Signal 11.

4.Harada K,Ito M,Wang X,Tanaka M,Wongso D,et al.(2017)Red fluorescentprotein-based cAMP indicator applicable to optogenetics and in vivoimaging.Sci Rep 7:7351.

5.https://montanamolecular.com/live-cell-camp-assay-caddis/red-caddis-camp-protocol/