[发明专利]一种多重免疫分子检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种多重免疫分子检测方法，包括如下步骤：获得表面连接有捕获分子的编码微球；通过所述捕获分子捕获目标免疫分子并加入酶标试剂，在所述编码微球表面形成酶标记的免疫夹心复合物；将表面修饰有免疫夹心复合物的编码微球驱动到微孔板的微孔中并密封；预定时间后通过光激发所述微孔板进行检测所述微孔板。本发明使蛋白检测达到飞克级别(fg/ml),比传统ELISA方法灵敏度高出1000倍。尤其对单分子检测具有极大的优势，在生命科学、体外诊断、伴随诊断、血液筛查、药物研发等方面有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于免疫分子检测领域，具体涉及一种多重免疫分子检测方法及试剂盒。

背景技术

传统的ELISA反应体系相对较大(100μl)，需要数百万分子产生数干万个荧光团信号才可以被酶标仪检测出，因此传统的ELISA方法只能检测到皮摩范围(10pg/ml)以上的信号，采用模拟算法。这种方法在现代科学已经达到了极限，远远不能满足临床要求。例如在外周血中的一些丰度低的蛋白分子对临床诊断及治疗的指导意义重大，但传统ELISA的灵敏度并无法检出这些分子，更无法达到灵敏的监控。ELISA一个样本一次实验只能检测一个指标。但急重症诊断或生物样品较少时(如婴幼儿血液，脑脊液等),临床要求免疫检测能够一个样本同时检测出多个蛋白指标，即多重检测。

为了提高免疫诊断的灵敏度，体外诊断厂家在传统酶联免疫(ELISA)的基础上，开发并商业化了磁微粒化学发光法和磁微粒电化学发光法。这两种方法采用和酶联免疫相同免疫夹心复合物的检测方法学，即用负载了捕获抗体的固定相捕获待测物分子，之后加入识别待测物分子的检测抗体形成免疫夹心复合物。检测抗体和捕获抗体识别待测物分子上不同的表位，而且检测抗体可以被能化学放大信号的酶或者电化学放大信号的小分子催化剂标记。最后检测到的放大信号和待测物分子浓度正相关。测试不同浓度的待测物标准品，将信号值和待测物浓度值进行线性拟合绘制校准曲线后，用相同的方法测试未知样品，得到的信号值用内插法带入标准曲线即测得未知样品中待测物的浓度。磁微粒化学发光法和磁微粒电化学发光法较酶联免疫相比采用磁微粒作为固定相，能更快更高效的捕获待测分子。较酶联免疫采用的酶催化化学显色，化学发光和电化学发光信号的信噪比提高了约十倍。在实际应用中这两种新的方法较传统的ELISA灵敏度提高了10-100倍，最高能到1pg/ml的灵敏度。在这种灵敏度下，可以有效检测血液中约200-300种有临床意义的蛋白指标，但另外上千种有或者潜在有临床意义的血液蛋白指标因为浓度较低，不能被有效检测到。

限制磁微粒化学/电化学发光法灵敏度的主要因素是检测的方法。带有酶标记夹心复合物的磁珠集中检测并给出一个宏观的连续信号。当抗原的浓度在10fg/ml到10pg/ml时，当单个磁珠上标记的酶分子少于10-100个，宏观集中观测的结果和背景(单个磁珠上标记0个酶分子)相差不多。

为了实现多重检测，体外诊断厂家利用免疫夹心复合物的检测方法学，开发并商业化了流式荧光发光法和微孔电化学发光法。流式荧光法采用微球作为固定相，用不同的荧光编码负载不同捕获抗体的微球，用流式细胞仪读取微球荧光编码和微球上免疫夹心复合物荧光标记物的信号。微孔电化学发光法将不同的捕获抗体微印刷到微孔中不同的位置，并通过成像的方法同时读取位置信息和免疫夹心复合物的电化学信号。这两种方法虽然能够实现多重检测。但荧光编码的微球，流式细胞仪，和在孔板中进行微印刷使检测的成本大幅升高。而且这两种方法和磁微粒化学/电化学发光法相比，灵敏度有所下降。

检测的最高灵敏度为单分子的检测，本专利在传统的模拟信号ELISA的检测条件下将每一个检测分子数字化，使蛋白检测达到飞克级别(fg/ml),比传统ELISA方法灵敏度高出1000倍。且采用了荧光编码液相芯片的样品检测方式，同时可检测至少15个标志蛋白，对节省样本量，提高检测研究方面的效率有极高应用价值。在生命科学、体外诊断、伴随诊断、血液筛查、药物研发等方面有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是，解决目前银基纳米催化剂的氧还原电催化活性低以及电化学稳定性不高的问题。