[发明专利]基于CNP的人未成熟卵母细胞双相体外成熟技术

说明书

本发明涉及一种促进人未成熟卵母细胞体外成熟技术。基于CNP的人未成熟卵母细胞双相体外成熟技术（CNP based biphasic IVM,C‑IVM）模拟卵母细胞体内发育的过程，分阶段实现卵母细胞体外成熟：从小窦卵泡获取未成熟卵冠丘复合体（cumulus‑oocyte complex,COCs）后，首先进行（1）预培养（pre‑IVM），利用C型利钠尿肽（C‑type natriuretic peptide,CNP）抑制卵母细胞减数分裂，同时促进卵母细胞的细胞质成熟；然后进行（2）体外成熟（IVM）培养，利用双调蛋白（amphiregulin,AREG）和FSH促进卵母细胞核成熟，排出第一极体，形成MII卵母细胞。本发明能够促进成熟度较低的人类卵母细胞在体外形成具有高发育潜能的成熟卵母细胞，显著改善目前IVM效率低下的状态，具有灵活、安全和高效的特点。

技术领域

本发明涉及一种人未成熟卵母细胞体外成熟（in vitro maturation, IVM）技术，特别是涉及一种促进成熟度较低的人未成熟卵母细胞体外成熟的技术方案。

背景技术

IVM技术是指将未成熟的卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complex, COC）从窦卵泡中取出后，在体外促进其发育成熟的一种技术。目前被国内外广泛采用的IVM方案为：对患者进行促排卵，注射HCG后36小时采卵，获取未成熟COCs→将未成熟COCs（或卵母细胞）置于添加有FSH、LH/HCG等成分的IVM培养液中培养24-48小时，获取MII卵→将MII卵进行ICSI授精形成胚胎以供使用。我们将这种体外成熟方案称为标准IVM（standard IVM）。通过现行的标准IVM技术所获成熟卵的质量和发育潜能极为低下：体外成熟率为50-67%，受精率可达63.5-77%，但是临床妊娠率仅为14%，活产率为7%。这一点严重制约了该技术的广泛应用。

发明内容

针对上述问题，我们研发了新一代的IVM技术，基于C型利钠尿肽（C-typenatriuretic peptide, CNP）的双相体外成熟技术（CNP based biphasic IVM, C-IVM）。本发明能够促进成熟度较低的（未接受促性腺激素（gonadotrophin, Gn）或仅接受少量Gn处理的）卵母细胞体外成熟，提高成熟卵的获卵率和发育潜能（受精率、卵裂率、囊胚率等）。

通过模拟卵母细胞体内发育成熟的生理过程，C-IVM方案包括以下三个阶段：（1）未成熟COCs转运阶段：用采卵针将未成熟COCs从小窦卵泡中取出后，将其置于添加有CNP的转运液中，维持37℃恒温进行转运，以保持卵母细胞处于GV期。（2）预培养阶段（pre-IVM）：从转运液中获取未成熟COCs后，将其置于添加有CNP的培养液中，抑制卵母细胞减数分裂，使其停滞在减数分裂GV期，在此期间促进卵母细胞的细胞质成熟。（3）体外成熟阶段（invitro maturation, IVM）：pre-IVM培养结束后，更换培养液，解除CNP对卵母细胞减数分裂的抑制作用。将COCs置于添加有FSH、双调蛋白（amphiregulin, AREG）和雌激素的体外成熟培养液中进行IVM培养，诱导未成熟卵母细胞恢复减数分裂，排出第一极体，获得成熟卵母细胞。

具体实施方式：

1. 培养液的配制

转运液：人输卵管液中添加10mg/ml 人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）,50nM CNP和20IU/ml肝素。

预培养液（pre-IVM）：α-MEM培养液中添加有rFSH 2.5mIU/ml、胰岛素5ng/ml、E₂10nM、CNP 25nM以及HAS 10mg/ml。在采卵前一天将pre-IVM培养液置于CO₂培养箱中平衡过夜。