[发明专利]一种创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法在审
| 申请号： | 201911253430.3 | 申请日： | 2019-12-09 |
| 公开（公告）号： | CN110777163A | 公开（公告）日： | 2020-02-11 |
| 发明（设计）人： | 王娟;王柏柯;李宁;余庆辉;黄少勇 | 申请（专利权）人： | 新疆农业科学院园艺作物研究所 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;C12N15/113;A01H5/00;A01H6/82 |
| 代理公司： | 65110 乌鲁木齐博亚思知识产权代理事务所(普通合伙) | 代理人： | 王志刚 |
| 地址： | 830091 新疆维吾尔自*** | 国省代码： | 新疆;65 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 番茄红素 番茄材料 果实 植株 番茄 基因 转基因番茄植株 农杆菌介导法 抗生素筛选 转基因成份 转基因技术 表达载体 纯合突变 番茄果实 分子育种 靶位点 高品质 构建 外源 自交 生物技术 筛选 转化 应用 | ||
1.一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于：在SISGR1基因（如SEQ ID NO.1所示）的第一个外显子和第二个外显子上设计两个gRNA靶位点，第一个gRNA靶位点的序列为：5’-TCTAAGCTCAACAATGAACA-3’，SEQ ID NO.2所示；第二个gRNA靶位点的序列为：5’-AGAACATATACACTGACTCA-3’，SEQ ID NO.3所示。
2.一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于，该创制方法包括以下步骤：
（1）通过酶切-连接，将两个gRNA，如SEQ ID NO.2所示和SEQ ID NO.3所示；整合到已构建好的植物表达载体pCGR1301-CRISPR/Cas9中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA载体；
（2）将pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA表达载体导入农杆菌中，得到pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌；
（4）以含SISGR1基因的低番茄红素含量的番茄为材料，用pCGR1301-CRISPR/Cas9-gRNA农杆菌侵染其外植体的下胚轴组织；
（5）诱导愈伤组织，经卡纳霉素抗性筛选，得到转基因阳性植株；
（6）获得阳性转基因株系后，经基因靶位点PCR扩增、测序、外援基因插入分析和突变体表型验证为阳性的纯合株系，即为完全丧失SISGR1功能且无外援基因插入的果实高番茄红素含量的番茄材料突变体。
3.根据权利要求2所述的一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的CRISPR/Cas9骨架载体为pCGR1301。
4.根据权利要求2所述的一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于：所述步骤（3）中的农杆菌为根瘤杆菌GV3101。
5.根据权利要求2所述的一种通过基因编辑创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的检测靶位点突变的PCR引物为：SISGR-F：5’-GGCTCTTAAATAAACTTCTTCC-3’，如SEQ ID NO.4所示；SISGR-R：5’-TACGCAACCTTAGTCCTACCT-3’，如SEQ ID NO.5所示。
6.权利要求1~5任一项所述的一种通过基因编辑技术创制果实高番茄红素含量的番茄材料的方法，所创制的果实高番茄红素含量的番茄材料在番茄育种中的应用。
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