[发明专利]PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法

权利要求书

1.PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：具体包括以下：

一、验证PSAP对神经退化变性的影响，具体包括，PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响；PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响；

二、细胞水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用；

三、动物水平验证PSAP在ALS发病机制中的作用。

2.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤一的PSAP对缺乏神经生长因子诱导的感觉神经元退化变性的影响具体方法包括以下，选取孕期14.5天野生型和PSAP基因敲除小鼠，取出胚胎，去除胚胎外胞膜，去除头、四肢和内脏，将其余胚胎转移至装有PBS的培养皿中冲洗，生物解剖显微镜下取出脊柱C1-C3区，用灭菌剪刀细细剪碎，连同PBS溶液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清，加3ml胰酶重悬沉淀，置于37℃水浴中消化20min；20min后，1000rpm离心5min，倒掉上清，加入10ml B27培养基重新悬浮，置于35mm细胞培养皿中，共四组，标记A、B、C、D，其中培养皿A和B为野生型小鼠中提取的细胞，培养皿C和D为PSAP基因敲除小鼠中提取的细胞；放于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育；第二天加神经生长因子，浓度为50μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO2恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察感觉神经元轴突的变化；

预冷的PBS冲洗细胞3次，去除剩余的培养液；

4％多聚甲醛室温固定，20min，预冷的PBS冲洗3次；

0.3％Triton X-100处理，5min，预冷的PBS冲洗3次；

10％山羊血清封闭30min；

弃去封闭液，加入10％山羊血清稀释一抗，4℃，过夜；

0.1％PBST洗3次，7min/次；加入10％山羊血清稀释荧光标记

二抗，室温，2小时；

0.1％PBST洗3次后，加入DAPI，5min；

0.1％PBST洗3次后，封片，荧光显微镜照相。

3.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤一PSAP对缺乏脑源神经营养因子和神经营养因子-3诱导的运动神经元退化变性的影响，操作包括以下选取孕期14.5天野生型和PSAP-/-小鼠，提取细胞方法如上，分别置于标记A、B、C、D的四个35mm细胞培养皿中，第二天加入脑源神经营养因子，神经营养因子-3，浓度均为10μg/ml，待细胞贴壁良好后，将培养皿B和D中培养基更换为不含神经生长因子的普通B27培养基，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中孵育48h后取出，去除培养基，用PBS液体冲洗，4％多聚甲醛固定，利用抗SV2抗体染色，通过免疫荧光实验，镜下观察运动神经元轴索的变化。

4.根据权利要求1所述的PSAP蛋白对于ALS疾病发病机制的作用及其验证方法，其特征在于：步骤二，选取NSC34细胞，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，24h后收集样品，通过CCK-8实验检测细胞死亡情况，Western blot实验检测PARP裂解片段，caspase活化，免疫沉淀实验检测SOD1-PSAP，PSAP-Bax，SOD1-Bax复合物；为研究PSAP的作用，在对照组及实验组细胞中分别转染非靶向性siRNA及PSAP特异性siRNA试剂，将提纯的质粒pcDNA3.1/LacZ-flag，pcDNA3.1/SOD1-flag以及pcDNA3.1/SOD1G93A-flag转染至细胞，检测PARP裂解片段，caspase活化，SOD1-Bax复合物的形成等。