[发明专利]一种NK细胞体外扩增培养的方法

说明书

本发明涉及一种NK细胞体外扩增培养的方法，该NK细胞体外扩增培养的方法，属于细胞培养领域，用CD16包被的培养瓶，筛除大量的T细胞，使NK细胞成为优势细胞群，用IL‑2、IL‑12、IL‑15、IL‑18、SCM、IFN‑γ刺激诱导NK细胞，再用含有IL‑2的无血清完全培养基扩增，得到大量高纯度的NK细胞。本发明解决现有技术中无法扩增得到大量、高纯度NK细胞的问题，该方法利用CD16包被的培养瓶，筛除大部分T细胞，使NK细胞成为优势细胞，刺激诱导扩增NK细胞；操作简单，容易实现，扩增效率高，在培养过程中不添加任何饲养细胞和导体血清，不会带来医学伦理和GVHD风险问题，适用于NK细胞临床实验研究及大规模制备。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及NK细胞体外扩增培养的方法。

背景技术

肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。目前国内外对癌症的治疗方法有手术切除、化学疗法及放射线疗法。针对肿瘤患者无法自主产生更有效的杀伤效应的细胞，科学家们发明了过继性免疫疗法。过继性免疫疗法是现今用于研究肿瘤治疗的热点，而且在临床得到广泛的应用。

NK细胞，又称自然杀伤细胞，NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群，是人体免疫细胞中的一种淋巴细胞，是先天免疫细胞的关键子集，被认为是机体控制肿瘤的发生、发展和转移的主要效应细胞之一，也是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。

近年来，关于NK细胞及其抗肿瘤功能的研究已经成为免疫学和肿瘤学研究的热点内容之一。NK细胞抗肿瘤已经在美国和日本等国家进行了大量的临床试验，显示了良好的应用前景。据国内外相关报道，体外扩增NK细胞的技术主要有三种：一是采用免疫磁珠细胞分选，从外周血单个核细胞得到纯化的NK细胞，在体外加入因子扩增培养；二是利用滋养层细胞K562细胞扩增原代NK细胞；三是直接利用因子刺激从外周血中扩增培养NK细胞。前两种扩增NK细胞的方法在临床上应用的安全性尚未得到验证，且K562细胞用为肿瘤细胞存在一定的风险，因此这两种方法多用于科研研究。第三种利用因子刺激扩增培养NK细胞的方法安全性较好，临床应用价值高，但扩增位数和纯度不高且不稳定。现在，国内外有科研人员发现先去除单个核细胞中的T细胞，更有利于NK细胞的扩增，这种方法可以直接使NK细胞成优势细胞群，更快地刺激诱导扩增NK细胞，这种方法用到磁珠，这就大大增大了NK细胞扩增的成本，不利于NK细胞大模式培养和临床研究。因此，寻找一种成本低、安全性好、扩增倍数高的NK细胞体外培养方法是很有必要的。

发明内容

本发明目的在于为了克服目前NK细胞体外培养的不稳定性、成本高等因素，利用培养瓶CD16包被的方法先去除T细胞，再对NK细胞诱导刺激扩增，提供了一种成本较低、扩增效率高的NK细胞培养体系，适用于NK细胞临床实验研究及大规模制备。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种NK细胞体外扩增培养的方法，其创新点在于：无需磁珠，利用CD16包被培养瓶，加入单个核细胞后NK细胞附壁，而T细胞悬浮，从而可以将T细胞去除，再用IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、SCM、IFN-γ多组合的方法刺激诱导NK细胞扩增，获得多数量、活性强的NK细胞；具体步骤如下：

（1）培养瓶包被处理：用含有CD16（浓度0.1μg/ml~20μg/ml）包被液铺满TC处理的培养瓶中，置于4℃冰箱，孵育过夜，或37℃孵育2h；包被完成后吸弃的包被液，并用PBS洗涤2次，备用；