[发明专利]大豆主栽品种的遗传转化、基因编辑及分析方法

权利要求书

1.一种基因编辑转化载体，其特征在于，基于CRISPR/Cas9系统，以农杆菌转化载体pCambia3301为骨架，设计提高Cas9和gRNA表达量的启动子，得到基因编辑转化载体。

2.根据权利要求1所述的基因编辑转化载体，其特征在于，所述基因编辑转化载体包含三个基因表达单元；所述基因表达单元从T-DNA的右边界顺序依次为GmU6-9pro:gRNA:AtU6-26、GmEF2pro:Cas9:PsRbcSE9和CaMV35S pro:Bar:CaMV 35S。

3.根据权利要求1所述的基因编辑转化载体，其特征在于，所述gRNA针对特定的植物基因设计。

4.根据权利要求3所述的基因编辑转化载体，其特征在于，所述植物为双子叶植物；优选的，所述植物为大豆。

5.根据权利要求3所述的基因编辑转化载体，其特征在于，针对GmFad2-1A基因和GmFad2-1B基因分别设计2个gRNA，并通过tRNA序列将这2个gRNA串联起来表达，得到基因编辑转化载体KF57。

6.一种植物品种的遗传转化方法，其特征在于，将权利要求1-5任一项所述的基因编辑转化载体导入植物细胞，再筛选得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。

7.根据权利要求6所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：受体植物进行遗传转化得到再生植株；

S2：检测再生植株的基因编辑是否成功；

S3：筛选得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。

8.根据权利要求7所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，所述植物为大豆；优选的，所述大豆品种为垦保小粒豆1号或龙垦314。

9.根据权利要求8所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，所述S1包括：

S11：活化携带有基因编辑转化载体的农杆菌；

S12：制备大豆外植体；

S13：将农杆菌和大豆外植体共培养；

S14：诱导长出丛生芽；

S15：培养丛生芽得到无根幼苗后诱导其生根，得到大豆幼苗；

S16：将大豆幼苗进行驯化移栽得到再生植株。

10.根据权利要求7所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，在S3中，将再生植株T0的种子种植萌发后得到后代植株T1，取叶片进行检测得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。

11.根据权利要求10所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，所述再生植株T0的基因组中针对GmFad2-1A基因或GmFad2-1B基因编辑的核苷酸序列如SEQ ID NO：31-41所示。

12.一种不携带外源基因的后代植株，其特征在于，通过权利要求6-10任一项所述方法制备得到。

13.根据权利要求12所述的后代植株，其特征在于，所述后代植株T1的基因组中针对GmFad2-1A基因或GmFad2-1B基因编辑的核苷酸序列如SEQ ID NO：42-55所示。

14.一种基因编辑产物的分子分析流程方法，其特征在于，采用PCR扩增结合DNA片段直接测序的分析方法，分三步进行，分别为PCR1、PCR2和PCR3；

PCR1：检测编辑载体的转化情况，阳性为转基因事件；

PCR2：扩增目标基因被编辑片段，用其中一个引物直接测序，编辑的片段会在编辑处开始出现套峰，克隆后再测序以确定编辑后的序列变化；

PCR3：其中一个引物的3‘端部分横跨野生型序列预期的Cas9切断点，以用于分析后代植株T1分离群体，阳性为野生型和杂合编辑，阴性为纯合或双等位基因编辑。

15.根据权利要求1-5任一项所述的基因编辑转化载体、权利要求6-10任一项所述的遗传转化方法、权利要求11-13所述的后代植株或权利要求14所述的基因编辑产物的分子分析流程方法在育种领域中的应用；优选的，所述育种领域为双子叶植物育种领域。