[发明专利]一种高亮度、快速标记的SNAP蛋白标签及其合成与生物应用

权利要求书

1.一种SNAP蛋白标签，其特征在于：该SNAP蛋白标签以四乙基罗丹明为母体，螺酯羧酸或底环羧酸位置引出甲胺丁酸后连接BG基团得到；

结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的SNAP蛋白标签的合成方法，其特征在于，具体制备过程如下：

RhoB-SNAP

(1)中间体RhoB-NHS的合成：在单口瓶中加入罗丹明B、缩合剂、N-羟基琥珀酰亚胺，加入二氯甲烷溶解，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，得到粗产品RhoB-NHS，直接进行下一步反应；其中罗丹明B、缩合剂、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:0.6-0.8:0.2-0.4，罗丹明B与二氯甲烷的质量与体积比为1:10-20(g/mL)；

(2)中间体RhoB-甲胺丁酸的合成：在单口瓶中加入粗产品RhoB-NHS、N- 甲基丁酸盐酸盐，加入色谱纯乙腈溶解，再向反应体系中加入有机碱，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝7-10：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体；其中RhoB-NHS、N-甲基丁酸盐酸盐的质量比为1:0.3-0.4，有机碱与乙腈的体积比为1:8-15，RhoB-NHS与有机碱的质量与体积比为1:2-3(g/mL)；

(3)蛋白标签RhoB-SNAP的合成：分别称取RhoB-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合剂盐酸盐、HOBt、碱试剂于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入无水DMF，室温搅拌两天后，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝5-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体SNAP蛋白标签RhoB-SNAP；其中，RhoB-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合剂盐酸盐、HOBt、碱试剂的质量比为1:0.3-0.7:0.1-0.5:0.1-0.5:1-3，RhoB-甲胺丁酸与无水DMF的质量与体积比为10-20:1(mg/mL)。

3.一种如权利要求1所述的SNAP蛋白标签的合成方法，其特征在于，具体制备过程如下：

RhoB-COOH-SNAP

(1)中间体RhoB-COOH的合成：在双口瓶中加入间二乙氨基苯酚、偏苯酸酐，抽充氮气三次后，升温至170℃，搅拌4h后，再向反应体系中加入酸性催化剂后，继续维持这个温度搅拌2h；降温降到70℃后，向反应体系中加入甲醇，回流搅拌30min，水洗，二氯甲烷萃取；收集有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-5：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体中间体RhoB-COOH；其中二乙氨基苯酚、偏苯酸酐的质量比为1:0.5-1，酸性催化剂与甲醇的体积比为1:1-3，二乙氨基苯酚与酸性催化剂的质量与体积比为1:1-3(g/mL)；

(2)中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸的合成：在单口瓶中加入混合物RhoB-COOH、缩合试剂、HOBt，抽充氮气三次后，加入无水DMF溶解，再向反应体系中加入碱试剂，室温搅拌30分钟后，再向反应体系中加入甲胺丁酸盐酸盐的无水DMF溶液，室温搅拌过夜；点板监测，待反应完毕后，停止反应；减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝10-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体中间体RhoB-COOH-甲胺丁酸；其中RhoB-COOH、缩合试剂、HOBt的质量比为1:0.3-0.4：0.3-0.5，无水DMF与碱试剂的体积比为5-15:1，RhoB-COOH与无水DMF的质量与体积比为20-60:1(mg/mL)；

(3)SNAP蛋白标签RhoB-COOH-SNAP的合成：分别称取RhoB-COOH-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合试剂、HOBt、碳酸钾于史莱克瓶中，抽充氮气3次保证其氮气氛围后，加入无水DMF，室温搅拌两天后，停止反应，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝5-3：1作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫红色固体；其中，RhoB-COOH-甲胺丁酸、BG标签分子、缩合试剂、HOBt、碳酸钾的质量比1:0.3-0.7:0.1-0.5:0.1-0.5:1-3，RhoB-COOH-甲胺丁酸与无水DMF的质量与体积比为10-20:1(mg/mL)。