[发明专利]一种表达荧光素酶的产酸克雷伯菌及其用途

说明书

本发明利用质粒构建和电转化技术，构建了含有荧光素酶基因簇（luciferase gene cassette,lux）的产酸克雷伯菌，经自发荧光鉴定及菌株的传代稳定性试验与培养特性的观察,最终获得了可稳定表达荧光素酶的产酸克雷伯菌（KOX‑LUX）。为研究产酸克雷伯菌相关疾病进展，筛选合适的杀菌方法、抗生素等提供重要的可视化研究工具。

技术领域

本发明涉及微生物医药领域，具体涉及一种含有荧光素酶基因的泛宿主质粒和稳定表达荧光素酶的产酸克雷伯菌的构建方法，该方法构建获得的菌株，以及该菌株在筛选杀菌方法或者筛选药物以及制备感染动物模型等方面的用途。

背景技术

产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca,KOX)是社区和医院感染常见的革兰氏阴性细菌，其表面的荚膜多糖是其主要的毒力因子。产酸克雷伯菌能够表达广谱β-内酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases,ESBL)和碳青霉烯酶，因此能产生β-内酰胺和碳青霉烯类抗生素耐药，已成为临床治疗的难题，因此，亟需有力工具评估现行抗生素使用的疗效、适合的药物，例如抗生素或其他杀菌方法的效果。

生物发光是生物体内在酶的作用下发光的现象。生物发光现象广泛存在细菌、昆虫等生物体中。利用萤光素酶基因(luciferas gene cassette，LUX)基因标记细胞的生物发光技术具有操作简便、结果直观、不依赖底物、对机体损伤小等优点。该技术已广泛应用于肿瘤生长监测和转移示踪、基因治疗、目标基因表达的检测等多个领域。

近年来研究表明，产酸克雷伯菌属于外科术后常见的感染细菌之一，但是对于该菌感染防控研究并未深入。传统制作克雷伯菌属感受态采用化学方法，制作过程繁琐且感受态效率不稳定。

发明内容

本发明将萤光素酶基因LUX A/B/C/D/E连接至质粒，构建包含LUX A/B/C/D/E基因簇的质粒，并将通过电转化至产酸克雷伯菌，经过传代，筛选可稳定表达荧光素酶的产酸克雷伯菌，并将其用于筛选合适的杀菌方法或者筛选药物以及制备感染动物模型等方面。因此，

本发明提供一种质粒，所述质粒包括荧光素酶基因簇LUX A/B/C/D/E。

优选的，所述质粒为泛宿主质粒，该质粒可以在大肠杆菌中完成构建过程，其启动子能够被产酸克雷伯菌在内的多种革兰氏阴性杆菌识别。

本发明还提供一种产酸克雷伯菌(KOX-LUX)，所述产酸克雷伯菌能稳定表达荧光素酶。

本发明还提供一种上述产酸克雷伯菌的构建方法，所述构建方法包括：

(1)制备包含LUX A/B/C/D/E基因簇的质粒；优选的，所述质粒为泛宿主质粒，更优选的，所述质粒为泛宿主质粒pBBR1。

(2)制备电转化感受态产酸克雷伯菌；

(3)将步骤(1)获得的包含LUX A/B/C/D/E基因簇的质粒电转化感受态产酸克雷伯菌，挑选阳性菌落。

优选的，所述步骤(1)包括：(a)将LUX A/B/C/D/E基因簇克隆至泛宿主质粒；(b)将质粒电转化至大肠杆菌感受态细胞；(c)筛选阳性大肠杆菌；(d)从阳性大肠杆菌中提取包含LUX A/B/C/D/E基因簇的泛宿主质粒。

进一步，所述步骤(a)包括①、LUXA/B/C/D/E基因簇扩增；②、pBBR1MCS-1双酶切；③、将步骤②的酶切片段胶回收后与步骤①扩增的LUXA/B/C/D/E基因簇使用Gibson连接方法连接获得环状质粒。

更进一步，步骤①LUX A/B/C/D/E基因簇扩增时采用高保真酶，其退火温度低于推荐温度2-4℃。

本发明还提供一种上述产酸克雷伯菌在筛选杀菌方法中的应用。