[发明专利]一种同时检测4种玉米病毒的多重RT-PCR方法

权利要求书

1.一种同时检测4种玉米病毒的多重RT-PCR方法，4种玉米病毒为：玉米褪绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus,MCMV）、甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV）、玉米黄花叶病毒（Maize yellow mosaic virus,MaYMV）、玉米相关的整体病毒（Maize-associated totivirus,MATV）其特征在于,具体包括以下步骤：

（1）将玉米叶片于研钵中，加入液氮后研磨成粉状，使用TaKaRa MiniBEST UniversalRNA Extraction Kit 试剂盒进行提取，将提取的RNA用M-MLV Reverse Transcriptas反转录酶进行反转录成cDNA，得到的cDNA可直接进行PCR反应或-80℃保存备用；

（2）以MCMV，SCMV，MaYMV 和MATV的外壳蛋白（CP）基因的保守序列为设计引物，以玉米EF1α基因作为内参基因，将MATV、MaYMV、SCMC、MCMV和EF1α的引物组合在一管中进行扩增，得到扩增产物：

第1对设计引物：EF1αF/EF1αR

EF1αF：5'-GCTTCACGTCCCAGGTCATC-3'

EF1αR：5'-TAGGCTTGGTGGGTATCATC-3'

第2对设计引物：MAF1/MAR1

MAF1：5'-GGACACCTTCGTCAGGCACT-3'

MAR1：5'-CAACTCCTGATTGTTCATTCCTC-3'

第3对引物：MYF1/MYR1

MYF1：5'-GACGCGCTCGCAATAATAAC-3'

MYR1：5'-GACGCGCTCGCAATAATAAC-3'

第4对引物：SC132F/SC627R

SC132F：5'-CAACAAGGGTCCGGTGGGGG-3'

SC627R：5'-TACGCTTCAGCTGCATCACT-3'

第5对引物：MC1F/MC670R

MC1F：5'-ATGGCGGCAAGTAGCCGGTC-3'

MC670R：5'-GCCTGGAACCAGGGCAGGTTG-3'

（3）取20μL步骤（2）得到的PCR产物在0.5×TBE缓冲液中1.5%琼脂糖凝胶电泳35分钟，然后在紫外光下进行观察和拍照，根据琼脂糖凝胶电泳结果判断病毒的类型，当琼脂糖凝胶电泳结果中显示690bp大小条带时，则样品中含有MCMV；当琼脂糖凝胶电泳结果中显示512bp大小条带时，则样品中含有SCMV；当琼脂糖凝胶电泳结果显示413bp大小条带时，则样品中含有MaYMV ；当琼脂糖凝胶电泳结果显示313bp大小条带时，则样品中含有MATV。

2.根据权利要求1所述同时检测4种玉米病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于：多重RT-PCR反应体系总体积为20μL，其中包含100ng/μL的cDNA 1μL , 10μL 2×EasyTaq PCRSuperMix, 10μmol/L的引物EF1αF、EF1αR各1 μL，10μmol/L的引物MAF1、MAR1各0.5 μL，10μmol/L的引物MYF1、MYR1各0.5 μL，10μmol/L的引物MYF1、MYR1各0.5 μL，10μmol/L的引物SC132F、SC627R各0.5 μL，10μmol/L的引物MC1F、MC670R各0.5 μL，其余为灭菌去离子水。

3.根据权利要求1所述同时检测4种玉米病毒的多重RT-PCR方法，其特征在于：多重RT-PCR的反应体系的条件：延伸时间为90s，循环周期数为35个循环，退火温度为56 ℃。