[发明专利]一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株及其构建方法

权利要求书

1.一种非洲猪瘟EP153R蛋白，其特征在于，所述的EP153R蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，其基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞株，其特征在于，所述CHO细胞株中插入了权利要求1所述的非洲猪瘟EP153R蛋白的核酸序列，该细胞株命名为CHO-EP153R，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月6日，保藏号为CGMCC No.18850。

3.如权利要求2所述高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法为基于电穿孔法使用权利要求1所述EPR153R蛋白的重组质粒转染宿主CHO细胞株，并对转染后的宿主CHO细胞进行克隆培养、筛选。

4.根据权利要求3所述的高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞的构建方法，其特征在于，重组质粒转染宿主CHO细胞株包括以下步骤，

A、培养基准备：配制含10％dFBS的CSC-03单克隆培养基，配置完毕后置于37℃培养箱预热；

B、宿主细胞准备：用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞CHO活细胞密度以及细胞活率，按照6000cells/well量取细胞，离心去除上清，并使用5mL电转培养基CD-pro清洗两次细胞，第二次清洗后使用600μL电转培养基将细胞重悬，待用；

C、取200μg EP153R蛋白的质粒加入到使用电转培养基重悬的细胞中；

D、设定电穿孔仪的电转程序为320V，900uF，∞，4mm；

E、将已溶解所需质粒的电转培养基重悬细胞转入电穿孔仪的电转杯，静置2min开始电转，并记录电转时长及电压；

F、电转完成后立即取出，并加入到预先准备好的含10％dFBS的单克隆培养基中，

吹吸混匀；

G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96孔板中，将96孔板置于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养。

5.根据权利要求4所述的高效表达非洲猪瘟EP153R蛋白的CHO细胞的构建方法，其特征在于，所述筛选的方法为将电转染后24小时的96孔板中的CHO细胞液添加蛋氨酸亚氨基代砜进行处理；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％dFBS的单克隆培养基；培养3天后扩出一副板24well板，37℃，5％CO₂条件下静置7天后，取其上清液进行检测，使用WB检测方式筛选阳性细胞株，即转染成功的细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无dFBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为无dFBS的CHO-K1培养基，培养三天；将培养后的细胞进行扩增加料，细胞活率60％左右时，收集上清，纯化，再进一步筛选得到最佳的已插入EP153R蛋白的CHO细胞株。