[发明专利]一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法

权利要求书

1.一种敲除水稻分蘖数调控基因OsFWL4以增加水稻分蘖数和产量的方法，其特征在于，所述的方法是利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4，所述水稻分蘖数调控基因OsFWL4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻分蘖数调控基因OsFWL4，其具体步骤为：

1）在水稻分蘖数调控基因OsFWL4的编码区选取靶标片段；

2）根据靶标片段的序列信息，合成带有粘性末端的接头引物，构建用于OsFWL4基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体；所述重组载体包括能在水稻细胞中表达的具有所述靶标序列的sgRNA表达盒和Cas9核酸酶表达盒；

3）将所述重组载体转入根癌农杆菌工程菌株中，利用农杆菌介导法转化常规粳稻品种，获得转基因水稻植株；

4）利用覆盖靶标位点的基因组引物对转基因植株基因组DNA进行扩增和序列测定，从而对T0代转基因植株进行基因型鉴定，获得纯合或双等位突变体；

5）利用生物信息学工具，对靶标序列的潜在脱靶位点进行预测；然后，利用基因组引物分别对纯合或双等位T0代突变体中预测概率最高的两个脱靶位点进行PCR扩增和序列测定，获得无可检测脱靶效应的纯合或双等位突变体；

6）对上述无可检测脱靶效应的纯合或双等位突变体在T1代进行种植，利用引物对T1代植株中的HPT、sgRNA和Cas9转基因进行PCR检测，即可获得无转基因插入、无可检测脱靶效应、单株分蘖数和产量显著增加的水稻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述靶标片段的序列为SEQ IDNo.5或SEQ ID No.6。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2）中，所述具有所述靶标序列的sgRNA表达盒的核苷酸序列如Seq ID No.3所示；所述Cas9核酸酶表达盒的核苷酸序列如Seq IDNo.4所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6）中，用于HPT、sgRNA和Cas9转基因扩增的引物序列分别为：

HPTF：5’-GGGTGTCACGTTGCAAGACC-3’，

HPTR：5’-ATGCCTCCGCTCGAAGTAGC-3’，

sgRNAF：5’-TCCCAGTCACGACGTTGTAA-3’，

sgRNAR：5’-GGCCATTTGTCTGCAGAAT-3’，

Cas9F：5’-CACCATCTACCACCTGAGAA-3’，

Cas9R：5’-CGAAGTTGCTCTTGAAGTTG-3’。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5）中，所述生物信息学工具为CRISPR-P 2.0或者CRISPR-GE。