[发明专利]可识别2’-O-甲基化修饰RNA的核糖核酸酶R及其应用

说明书

本发明利用基因工程对核糖核酸酶R进行氨基酸优化，获得了可识别2’‑O‑甲基化修饰RNA的核糖核酸酶R。具体为生殖支原体来源的核糖核酸酶R氨基酸序列的第277、455、456、457、459、460、461、464、465、467、562位中的一个或多个位点的氨基酸发生突变，或者大肠杆菌来源的核糖核酸酶R氨基酸序列的第273、557氨基酸序列中的一个或多个位点的氨基酸发生突变。本发明所述的核糖核酸酶能够快速鉴定2’‑O‑甲基化修饰的RNA，能够从2’‑O‑甲基化修饰和非2’‑O‑甲基化修饰的RNA混合物中，特异性分离筛选2’‑O‑甲基化修饰的RNA，并进行富集或者纯化。本发明所述的可识别2’‑O‑RNA甲基化修饰的核糖核酸酶R在生命科学研究以及医学检验过程中具有潜在应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术、基因工程以及蛋白质工程领域，具体涉及一种由基因工程改造的可识别2’-O-甲基化修饰RNA核糖核酸酶R(Ribonuclease R，RNase R)及其在检测、筛选2’-O-甲基化修饰的RNA中的应用。

背景技术

RNA的2’-O-甲基化修饰是一种由RNA甲基化酶或纤维蛋白酶介导的，在RNA核糖的2’位置上发生甲基化的化学修饰。研究表明，2’-O-RNA甲基化修饰在mRNA、tRNA、rRNA、sRNA、miRNA等分子上分布广泛并且在哺乳动物、酵母、植物、病毒等生物中普遍存在。在结构层面上，RNA的2’-O-甲基化修饰通过提高核苷酸的疏水性进而增强其稳定性。已有研究表明，2’-O-RNA甲基化影响mRNA与蛋白的结合、调控rRNA的翻译效率、参与tRNA的识别。近年来，2’-O-RNA甲基化修饰作为一类新型的RNA甲基化表观修饰，是继m6A之后的又一表观转录组学热点。

人细胞中的RNA 2’-O-甲基化修饰缺陷常常与疾病密切相关,潜在的RNA 2’-O-甲基修饰酶已经成为药物研发的新靶点。2019年法国蒙彼利埃大学Yamina课题组首次发现HIV病毒上存在2’-O-甲基化位点，其感染宿主细胞的活性受甲基转移酶FTSJ3调控。HIV病毒RNA上的2’O-甲基化修饰让它成功逃离了MDA5的感应，从而完成了免疫逃逸。因此，2’-O-甲基化修饰是哺乳动物细胞识别“自我”和“非我”RNA的重要标记。

核糖核酸酶是一类能够水解不同类型的RNA分子的蛋白质。核糖核酸酶具有一定的底物专一性和作用模式特异性。RNase R是属于RNR超家族的一类3’-5’核糖核酸外切酶，可按3’-5’方向将RNA逐步切割成单核苷酸。RNase R在生物界广泛存在，不同生物来源的RNase R具有不同的核糖核酸酶活性。例如大肠杆菌来源的核糖核酸酶R(Escherichiacoli RNase R，EcR)不具有RNA序列特异性，不能识别甲基化等表观修饰，并且在水解RNA过程中不产生任何的中间产物。生殖支原体核糖核酸酶R(Mycoplasma Genitalium RNase R，MgR)虽然能够很弱的识别RNA上的2’-O-甲基化修饰，水解反应中暂时停留在甲基化修饰位点，但是会继续降解中间产物，水解反应产物与非2’-O-甲基化修饰RNA的相同。

利用对核糖核酸酶R的改造，实现对2’-O-甲基化修饰RNA的识别，将会丰富人们对2’-O-RNA甲基化修饰的生物学功能的认知；在探索2’-O-甲基化修饰RNA在人类疾病的致病机制上具有潜在的应用前景。

发明内容

本发明通过结构生物学手段，解析了核糖核酸酶R与RNA复合物的三维晶体结构，发现RNA上2’-O位置与MgR的氨基酸氢键相互作用，分析核糖核酸酶R对2’-O-甲基化修饰RNA敏感活性的关键的作用的氨基酸，利用基因工程对其进行氨基酸优化，获得了可识别2’-O-甲基化修饰RNA核糖核酸酶R。

本发明具体技术方案如下：

一种可识别2’-O-RNA甲基化修饰的核糖核酸酶R，其特征在于：生殖支原体来源的核糖核酸酶R(MgR)氨基酸序列的第277、284、455、456、457、459、460、461、464、465、467、562位中的一个或多个位点的氨基酸发生一种或几种突变。