[发明专利]一种制备N-乙酰氨基半乳糖转移酶的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于表达N‑乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统。本发明提供一种用于表达N‑乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体，所述表达载体中包括ppGalNAc‑T蛋白表达框和PDI蛋白表达框。本发明所提供的用于表达N‑乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达载体和原核表达系统使用共表达单一质粒及具有胞内氧化环境的宿主细胞、并通过常规的通用培养基进行表达，表达系统和操作方法均简单，一步表达、纯化，不需要重折叠等后续操作，且获得ppGalNAc‑T2酶的产量优于人源HEK 293T细胞系表达纯化的ppGalNAc‑T2酶。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统，并进一步提供了通过上述用于表达N-乙酰氨基半乳糖转移酶的原核表达系统制备N-乙酰氨基半乳糖转移酶的方法。

背景技术

糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰形式，不仅参与蛋白质剪切加工、细胞增殖分化、免疫炎症等过程，还对重组蛋白类药物具有重要影响。约70％重组蛋白类药物在天然状态下带有糖基化修饰，其中N-糖链和O-糖链在蛋白质药物中最为常见。缺乏糖基化修饰会导致这些蛋白药物在体内的半衰期变短或药效降低，例如缺少N-糖基化修饰的人干扰素γ会被蛋白酶降解，从而导致其半衰期缩短；促排卵药物Corifollitropin alfa(FSH)缺乏N-糖基化修饰会导致其热变性，效价降低；母乳蛋白中的O-糖基化修饰对母乳喂养婴儿的健康有益，这种人乳寡糖(HMOs)不仅可以为大脑提供营养，还可以调节肠道微生物，诱导免疫细胞应答。

目前糖链合成共存在三种方法：1、从天然产物中分离纯化；2、使用化学合成法合成；3、使用糖基转移酶催化合成。糖基转移酶用于酶法合成糖链不仅特异性好，且获得糖链的纯度极高，但是体外酶法合成N-糖链和O-GalNAc糖链需要大量糖基转移酶。目前为止除了合成O-GalNAc糖链的ppGalNAc-T糖基转移酶以外，多数人源糖基转移酶可用细菌或酵母来源的同工酶进行人源酶的替代，例如甘露糖基转移酶Alg1、Alg2、Alg3、Alg9；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶β3GNT；唾液酸转移酶ST3Gal1；半乳糖转移酶B4GalT1。细菌或其他物种来源的糖基转移酶或糖苷酶不仅可以用于人源N-糖链和O-GalNAc糖链的合成，还可以用于糖基化工具酶的开发。2019年，Hong,S.等人对细菌来源的岩藻糖转移酶进行改造，开发了一种细胞表面糖链编辑的技术。该技术可以用于细胞表面糖链合成与标记，肿瘤细胞表面被标记的糖链可以被单克隆抗体所特异性识别从而用于肿瘤的靶向治疗。由于迄今为止，尚未在细菌或酵母体内发现ppGalNAc-T酶的同工酶，因此，ppGalNAc-T酶成为蛋白质初始O-GalNAc糖基化体外快速合成、大量制备O-GalNAc糖链的限速因素，开发制备活性稳定高产的ppGalNAc-T酶对填补蛋白质O-糖链合成技术缺陷以及后续运用酶工程改良生产糖基化工具酶具有重要意义。目前ppGalNAc-T酶的获得主要通过真核表达纯化系统，如人源模式细胞HEK293、昆虫细胞SF9、SF21中表达纯化。2002年，Guo,J.M.等人使用昆虫细胞Sf21表达纯化了有活性的ppGalNAc-T12酶。2003年，Zhang,Y.等人使用Sf21细胞表达纯化了有活性的ppGalNAc-T13酶。利用真核表达纯化系统获得ppGalNAc-T酶的优势是：纯化得到的糖基转移酶保持了原有翻译后修饰，不需要进行密码子优化。但缺点是分泌量低，表达细胞培养成本高，无法实现糖基转移酶的大批量生产等。因此建立低成本，高效，大量生产活性ppGalNAc-T酶的原核表达系统，对于后续将ppGalNAc-T酶应用于重组蛋白药物生产，控制其O-GalNAc糖基化水平，提升重组蛋白药物的效价、以及糖基化工具酶的开发都具有十分重要意义。