[发明专利]改良六孔板及基于该六孔板的细胞免疫荧光染色方法

权利要求书

1.一种改良六孔板，其特征在于：包括培养板体、盖体与六个培养孔，六个所述培养孔的开口均向上，且其阵列分布在所述培养板体上，所述盖体设置在所述培养板体的上端，可拆卸地覆盖在所述培养板体上，所述培养孔的底端表面上开设有开口向上的倒圆台形凹槽，显微盖玻片的直径大于所述倒圆台形凹槽的底端表面直径，小于所述倒圆台形凹槽的上端开口直径，所述倒圆台形凹槽的侧边缘开设有用于插入镊子的预留槽，在进行细胞培养时，显微盖玻片置于所述倒圆台形凹槽的内部，通过将镊子插入所述预留槽中可将显微盖玻片夹起取放。

2.根据权利要求1所述的改良六孔板，其特征在于：六个所述培养孔按两行三列阵列分布在所述培养板体上，相邻两个所述培养孔之间的距离相等。

3.根据权利要求1所述的改良六孔板，其特征在于：所述预留槽可为三角锥形凹槽，所述三角锥形凹槽沿所述倒圆台形凹槽的侧边缘向下延伸，至所述倒圆台形凹槽的底端表面截止。

4.根据权利要求1所述的改良六孔板，其特征在于：所述预留槽也可为半圆锥形凹槽，所述半圆锥形凹槽沿所述倒圆台形凹槽的侧边缘向下延伸，至所述倒圆台形凹槽的底端表面截止。

5.根据权利要求1所述的改良六孔板，其特征在于：所述改良六孔板还包括底板、圆形封盖，所述圆形封盖设置在各倒圆台形凹槽的底端并将其底端密封，所述底板插接在所述培养板体的下端，位于所述圆形封盖的下端，并向上挤压所述圆形封盖。

6.根据权利要求5所述的改良六孔板，其特征在于：所述圆形封盖与所述培养板体之间设置有锯齿状槽，所述锯齿状槽分别设置在所述圆形封盖与所述培养板体上，所述圆形封盖上的所述锯齿状槽设置在其上端表面边缘，所述培养板体上的所述锯齿状槽设置在所述培养板体与所述圆形封盖连接处表面。

7.基于如权利要求1～6任一所述的改良六孔板的细胞免疫荧光染色方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：细胞爬片

将多个显微盖玻片用镊子分别放入倒圆台形凹槽中，然后将细胞均匀种植到含有显微盖玻片的改良六孔板中的倒圆台形凹槽内，让细胞在显微盖玻片上贴壁生长24小时；

S2：毒素处理

待细胞生长至对数生长期后，将原培养基吸弃，再用含有不同浓度的MC-LR的DMEM完全培养基培养细胞24小时，对照组加入等体积的DMEM完全培养基；

S3：细胞固定

吸弃改良六孔板中含有毒素的培养基，用PBS溶液清洗显微盖玻片2次，向各培养孔中加入1mL的3％戊二醛溶液，室温固定细胞10分钟，然后吸弃改良六孔板中的固定液，用PBS溶液清洗显微盖玻片3次，每次清洗时长为5分钟；

S4：穿膜

向每个培养孔中加入1mL的1％穿膜液，室温孵育10分钟，穿膜液为1mL Triton X-100溶于100mL PBS溶液中；穿膜结束后，吸弃1％穿膜液，用PBS溶液清洗1次；

S5：封闭

向每个培养孔中加入1mL的无蛋白快速封闭液，封闭10分钟；

S6：一抗孵育

回收无蛋白快速封闭液后，用无蛋白快速封闭液将兔来源的γ-H2AX一抗按照1：1000的倍数稀释，将抗体稀释液加到倒圆台形凹槽内部，用镊子沿预留槽伸入倒圆台形凹槽内把显微盖玻片夹起，使含有细胞的一面与抗体稀释液接触，倒扣于倒圆台形凹槽内，在37℃孵育30分钟后，再用镊子沿预留槽伸入倒圆台形凹槽内把显微盖玻片夹起，使含有细胞的一面朝上，用移液器将倒圆台形凹槽内的一抗稀释液吸弃，再用0.2％PBST溶液清洗显微盖玻片6次，0.2％PBST溶液为200μL Tween-20溶于100mL PBS中，每次清洗时长为5分钟，以便去除残余一抗；

S7：二抗孵育

用无蛋白快速封闭液将Alexa 488荧光标记的山羊抗兔二抗按照1：1000的倍数稀释，将抗体稀释液加到倒圆台形凹槽内部，用镊子沿预留槽伸入倒圆台形凹槽内把显微盖玻片夹起，使含有细胞的一面与抗体稀释液接触，倒扣于倒圆台形凹槽内，在37℃避光孵育20分钟后，再用镊子沿预留槽伸入倒圆台形凹槽内把显微盖玻片夹起，使含有细胞的一面朝上，用移液器将倒圆台形凹槽内的二抗稀释液吸弃，再用0.2％PBST溶液避光清洗显微盖玻片6次，每次清洗时长5分钟，以便去除残余二抗；

S8：细胞核复染

用1μg/mL的Hoechst33342避光染核2分钟，用PBS溶液避光清洗5次，每次清洗时长5分钟；

S9：显色

在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片剂，然后把经抗体标记的显微盖玻片中有细胞的一面倒扣于抗荧光淬灭封片剂上，吸弃显微盖玻片周围多余的抗荧光淬灭封片剂，然后于荧光显微镜下观察并拍照。