[发明专利]一种厦门链霉菌及其生物合成苯并吡喃类和4-氢喹啉类化合物的方法

权利要求书

1.一种厦门链霉菌，其特征在于，通过将质粒pIB1884-xim2转移至菌株StreptomycesxiamenensisΔximΔika中构建得到；

所述质粒pIB1884-xim2的序列如SEQ ID NO.1所示；

所述菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika的构建方法包括以下步骤：

A1、以厦门链霉菌基因组DNA为模板，分别PCR扩增厦门霉素生物合成基因簇(xim)上下游的片段，然后通过酶切连接克隆至pJTU1278的XbaI/HindIII酶切位点，获得过渡质粒；然后以pIB139为模板，PCR扩增编码阿泊拉霉素的抗性基因aac(3)IV，克隆至前述过渡质粒的KpnI酶切位点从而获得基因敲除质粒pDxim，将质粒pDxim导入野生型厦门链霉菌318中，筛选得到基因簇xim被同框敲除菌株Δxim；

A2、以厦门链霉菌基因组DNA为模板，分别PCR扩增多环稠合大环内酰胺化合物合成基因簇(ika)上下游的片段以及一段包含attB位点的序列，然后隆至pJTU1278的XbaI/HindIII酶切位点获得过渡质粒；然后将编码阿泊拉霉素的抗性基因aac(3)IV克隆至该过渡质粒的KpnI酶切位点，从而获得基因敲除质粒pKIattB；

A3、将质粒pKIattB通过接合转移导入步骤A1得到的菌株Δxim中，筛选获得基因簇ika被attB替换的突变菌株，即得菌株Streptomyces xiamenensisΔximΔika。

2.根据权利要求1所述的厦门链霉菌菌株，其特征在于，所述质粒pIB1884-xim2的构建方法包括以下步骤：

S1、合成含有内源性组成型启动子18840p以及同尾酶的DNA片段，并克隆至pIB139的NsiI/EcoRI位点生成质粒pIB1884；

S2、以Streptomyces xiamenensis318基因组为模板，扩增含厦门霉素合成基因ximB、ximC、XimD和XimE的目的片段；

S3、将步骤S2得到的目的片段与质粒pIB1884重组，然后转化，即得质粒pIB1884-xim2。

3.根据权利要求2所述的厦门链霉菌菌株，其特征在于，步骤S2中，所述扩增采用的引物对序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

4.一种根据权利要求1-3任一项所述的厦门链霉菌菌株在生产苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物中的应用；所述苯并吡喃类化合物为所述4-氢喹啉类化合物为

5.一种苯并吡喃类化合物和4-氢喹啉类化合物的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1-3任一项所述的厦门链霉菌株接入培养基中预培养，然后进行发酵培养并喂养相应4羟基苯甲酸类似物，培养后，萃取即得；苯并吡喃类化合物为所述4-氢喹啉类化合物为

6.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，生产苯并吡喃类化合物时，所述发酵培养过程为：28～30℃之间，200～220rpm之间培养6-10天；且在培养1天后加入终浓度为50～110mg/L的2,4-二羟基苯甲酸或2-氯-4-羟基苯甲酸。

7.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，生产4-氢喹啉类化合物时，所述发酵培养过程为：28～30℃之间，200～220rpm之间培养6-10天；且在培养1天后加入终浓度为50～110mg/L的4-氨基苯甲酸。

8.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述预培养采用的培养基为含30～50μg/mL阿泊拉霉素的TSB培养基，培养28～36小时。