[发明专利]一种积累大黄素-8-甲醚的工程菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种能够积累大黄素‑8‑甲醚的基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为能够产生大黄素‑8‑甲醚或其下游衍生物的土曲霉，所述基因工程菌株为将土曲霉中的gedK基因进行突变而制备得到的基因工程菌株，相对于出发菌株和gedD基因突变菌株，所述基因工程菌株能够用于积累大黄素‑8‑甲醚。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种积累大黄素-8-甲醚的工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

以大黄素为代表的蒽醌类化合物是蓼科、豆科、鼠李科等植物产生的重要次级代谢产物，是常用中药大黄、芦荟、何首乌的有效成分，具有多样的生物学活性。其中大黄素-3-甲醚已被开发为低毒环保的生物农药，用于绿色和有机蔬菜的生产中白粉病、霜霉病、灰霉病和炭疽病的防治。与其甲基化位置不同的同分异构体大黄素-8-甲醚(Questin，1,6-Dihydroxy-8-methoxy-3-methyl-9,10-anthracenedione，1,6-二羟基-8-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌，CAS Registry Number3774-64-9，图1)，主要存在于豆科植物决明(Cassiaobtusifolia)的种子中。研究表明，它对某些革兰氏阴性细菌具有抑制活性，又因其抗氧化活性使其具有神经保护作用。此外，它还对小麦白粉病、稻瘟病和烟草赤星病等植物病害具有防治效果，具有开发成新型生物农药的潜力。但是，大黄素-8-甲醚在植物中的含量低，直接分离提取成本高，植物生长条件苛刻，生长周期长，受环境因素影响大，从而限制了其下游开发应用。在某些丝状真菌培养物中也发现过大黄素-8-甲醚，但是含量很低，因为它作为某些次级代谢产物的中间体，无法大量积累。

近些年，快速发展的组学分析技术以及基因工程技术推动了代谢工程和合成生物学的快速发展。利用基因工程技术定向改造微生物的代谢途径，或者基于合成生物学概念理性(设计)重组以获得植物源中药活性物质受到广泛关注。

大黄素-8-甲醚是土曲霉地曲霉素生物合成途径中的一个中间体化合物，在正常条件下只有极少量的合成且不能有效积累。本发明利用基因工程策略改造丝状真菌，使其高效积累大黄素-8-甲醚，开发出一种通过发酵合成制备大黄素-8-甲醚的新方法，为大黄素-8-甲醚的进一步开发应用打下基础。

发明内容

本发明提供了一种能够积累大黄素-8-甲醚的基因工程菌株，所述基因工程菌株的出发菌株为土曲霉(Aspergillus terreus)。

优选的，所述基因工程菌株的出发菌株为能够产生大黄素-8-甲醚或其下游衍生物的土曲霉；在一个实施方式中，大黄素-8-甲醚的下游衍生物包括Desmethylsulochrin，Sulochrin，Dihydrogeodin，Geodin，ω-Hydroxyemodin-5-methylether，Hydroxydesmethylsulochrin，Hydroxysulochrin中的一种或任意几种。

所述基因工程菌株为通过将土曲霉中gedK基因进行突变所得到的基因工程菌株。所述gedK基因所编码的蛋白为拜尔-维利格氧化酶(Baeyer-Villiger oxidase)。本发明所述的突变包括通过基因缺失、基因插入或基因取代导致的基因功能至少部分失活的方式；在优选的实施方式中，所述至少部分失活为基因功能全部失活。

gedK基因的序列包括编码具有拜尔-维利格氧化酶(Baeyer-Villiger oxidase)活性的核酸序列；优选的，所述gedK基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。应当理解，本发明所述gedK基因编码的氨基酸序列还包括与目的序列具有高度同源性的序列但不丧失原核苷酸序列或氨基酸序列的活性的序列，优选的，所述高度同源性包括与目的序列的同源性至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、或70％的序列。