[发明专利]一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法

说明书

本发明属植物性毒物毒性评价技术领域，针对现有研究不能阐释枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用的现状，提供一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法；收集枣花病蜜蜂并以健康蜜蜂作为对照，采集这两组蜜蜂的血淋巴，采用UPLC‑Q‑TOF MS技术结合多维统计分析对样本进行全谱分析，获得一级质谱和二级质谱数据，采用XCMS软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，从代谢物中筛选与蜜蜂枣花病有关的代谢物靶标和代谢轮廓，以代谢物靶标分析和代谢轮廓分析为指导，开展枣花花蜜对蜜蜂致病性的追踪、筛选，阐述枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用机制。本发明具有成本低，易于操作，检测快速，灵敏度高，选择性强，重复性好，获得信息全面等优点。

技术领域

本发明属于植物性毒物毒性评价技术领域，具体涉及一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法；基于分子生物学的评估方法，通过研究枣花花蜜对意大利蜜蜂代谢路径的影响，评估枣花花蜜对蜜蜂毒性效应。

背景技术

枣花病又称枣花中毒，常发生于枣花流蜜期，蜜蜂采集枣花蜜后造成大量采集蜂死亡，蜂群的群势下降。枣花病不仅影响枣花期蜂蜜和王浆的产量，还会影响蜜蜂对枣树的授粉。关于枣花病的病因，一般认为气候干旱、蜜汁浓稠、枣花花蜜中较高的钾离子浓度等有关。然而这些研究大多建立在推测及以成熟枣花蜜来研究蜜蜂枣花病的成因。但是蜜蜂采集的花蜜需经过一系列复杂过程才成为成熟蜂蜜，其中包括花蜜成分的改变。因此成熟枣花蜜对蜜蜂的作用并不能解释枣花花蜜对蜜蜂的毒性效应。鉴于此，探索和建立一种快速、敏感性高的分析技术尤为重要，这有助于阐明蜜蜂枣花病的发生原因，为蜜蜂枣花病的防治提供理论依据。

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一种研究生物系统的组学方法，主要研究在新陈代谢的动态过程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质。由于细胞内的生命活动大多发生于代谢层面，如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等, 故代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。作为一门新兴的学科，代谢组学是一类全面、高通量、无偏差地研究生物体内代谢途径的分析技术，可以提供有关毒理、药物毒理、药效临床诊断以及基因功能的信息。

发明内容

本发明的目的是针对现有研究不能阐释枣花花蜜对蜜蜂的毒性作用的现状，提供一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法；基于代谢组学的差异物代谢通路，以挖掘引起蜜蜂枣花病发生的机理，为蜜蜂枣花病的防治提供依据。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于代谢组学的枣花花蜜致蜜蜂毒性效应的研究方法，收集枣花病蜜蜂并以健康蜜蜂作为对照，采集这两组蜜蜂的血淋巴，采用UPLC-Q-TOF MS技术结合多维统计分析对样本进行全谱分析，获得一级质谱和二级质谱数据，随后采用XCMS软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，使用SIMCA软件对质谱数据进行多维统计分析；从代谢物中筛选与蜜蜂枣花病有关的血淋巴异常代谢物靶标和代谢轮廓，获得代谢指纹图谱；在枣花病组中显著上调的，VIP值5的代谢产物17种，下调的代谢产物18种；以血淋巴代谢物靶标分析和代谢轮廓分析为指导，开展枣花花蜜对蜜蜂致病性的追踪、筛选，阐述枣花花蜜对蜜蜂毒性的作用机制；显著差异的代谢产物主要富集到5个代谢通路，这5个相关代谢通路参与了蜜蜂对枣花花蜜的代谢过程。

具体步骤如下：

（1）采样提取代谢物：采集患枣花病的蜜蜂，并以同期健康蜜蜂作为对照，带回实验室后采集血淋巴并提取代谢物；

（2）分离代谢物：对提取的代谢物采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统UHPLC，HILIC色谱柱进行分离；

（3）分析样品：样品经UHPLC分离后用Triple-TOF 5600质谱仪AB SCIEX进行质谱分析；

（4）分析质谱数据：用XCMS软件对数据进行峰提取和代谢物鉴定，并使用SIMCA软件对质谱数据进行多维统计分析。