[发明专利]一种耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体H328D及其应用

说明书

本发明涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，公开了一种耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体H328D及其应用，突变体H328D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该突变体在高浓度NaCl和KCl中稳定性较好，经3.0～30.0％(w/v)的NaCl处理60min后，活性为44～60％；经3.0～30.0％(w/v)的KCl处理60min后，活性为73～105％。本发明的耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体H328D可应用于食品、农业、污水处理等行业。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及蛋白质改造技术，具体为一种耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体H328D及其应用。

背景技术

木聚糖是构成植物半纤维素的主要组分，广泛存在于植物细胞壁中，在高等植物和农业废料中约占干重的20％。内切木聚糖酶(endo-1,4-β-D-xylanase，EC 3.2.1.8)可随机地切割木聚糖的主链骨架，生成低聚木糖，木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC 3.2.1.37)可将低聚木糖水解为木糖(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews,2005,29:3～23.)，木糖可作为微生物等生物利用的碳源，或作为原料生产乙醇、乳酸、木糖醇等。

盐广泛存在于在自然界和各种生产实践中，包括食品、农业、污水、洗涤、制革、造纸等。例如，氯化钠广泛用于腌制食品中，氯化钾是在农业种植中应用相对广泛的一种化肥。然而，盐对酶的性质能产生巨大的影响。在中性盐中，酶会发生盐析作用，导致大部分的酶在高盐浓度下不具有良好的催化活性。不耐盐的木糖苷酶将无法和氯化钠同时使用，不利于腌制食品的改良；不耐盐的木糖苷酶将无法和化肥同时施用，不利于降解农业废料中的低聚木糖，从而导致木聚糖的循环利用降低，进一步导致土壤肥力降低。因此，为了使木糖苷酶在高盐环境生物技术领域具有更好的应用性，需要提高木糖苷酶在盐中的稳定性。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的旨在提供耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体H328D，H328D可应用于食品、农业、污水处理等行业。

为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明通过蛋白质改造技术，设计了耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体H328D，所述的突变体H328D的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，与GenBank记录的木糖苷酶序列AQM74402(SEQ ID NO.3)相比，H328D的第328位氨基酸为天冬氨酸，而AQM74402的第328位氨基酸为组氨酸。

所述的突变体H328D在不同盐中的稳定性不同：H328D经3.0～30.0％(w/v)的NaCl处理60min后，活性为44～60％；该突变体经3.0～30.0％(w/v)的KCl处理60min后，活性为73～105％；该突变体经3.0～30.0％(w/v)的Na₂SO₄处理60min后，活性剩余34～64％。

本发明提供了所述的耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体H328D的编码基因h328d，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的在于提供包含木糖苷酶突变体H328D编码基因的重组载体。

本发明的另一目的在于提供包含木糖苷酶突变体H328D编码基因的重组菌。

另外，本发明所述的木糖苷酶突变体H328D在食品、农业和污水处理的应用也在本发明的保护范围内。

本发明所述的耐氯化钠和氯化钾的木糖苷酶突变体H328D的制备方法，具体包括以下步骤：

1)合成突变体H328D的编码基因h328d(SEQ ID NO.2)；

2)将(1)中合成的序列和表达载体pEasy-E1相连接，即可获得包含h328d的表达载体；