[发明专利]一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法

说明书

一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖‑6‑磷酸的方法，属于酶工程领域，本发明包括克隆耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，亲和层析纯化获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；将浓度为0.01‑10μg/ml的重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、浓度为0.1‑20mM的果糖‑6‑磷酸和浓度为0.1‑20mM的二磷酸尿苷葡糖在70℃下反应1‑24h获得蔗糖‑6‑磷酸。该重组耐高温蔗糖磷酸合成酶最适反应温度为70℃，可耐受温度达100℃，能够在100℃保持酶活性，并催化蔗糖‑6‑磷酸的生成，适用于工业生产蔗糖‑6‑磷酸。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法。

背景技术

蔗糖磷酸合成酶(EC 2.4.1.14)(Sucrose-phosphate synthase，SPS)属于GT-B型糖苷转移酶。SPS存在于植物、蓝藻等生命体中。SPS是植物和蓝藻合成蔗糖的一个关键酶，也是合成蔗糖的限速酶。植物和蓝藻可进一步应用磷酸蔗糖磷酸化酶(SPP)水解蔗糖-6-磷酸上的磷酸根而生成蔗糖。

目前，由于蔗糖-6-磷酸的制备和纯化具有一定难度，因此在世界范围内，蔗糖-6-磷酸还没有被商业化。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，以使蔗糖-6-磷酸商业化。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的一种利用重组耐高温蔗糖磷酸合成酶合成蔗糖-6-磷酸的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞；

步骤二、克隆或合成耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因，构建过表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)中；

步骤三、诱导表达耐高温蔗糖磷酸合成酶，经亲和层析纯化后获得重组耐高温蔗糖磷酸合成酶；

步骤四、将重组耐高温蔗糖磷酸合成酶、果糖-6-磷酸和二磷酸尿苷葡糖在70℃条件下反应1-24h，获得蔗糖-6-磷酸；所述重组耐高温蔗糖磷酸合成酶的浓度为0.01-10μg/ml，所述果糖-6-磷酸的浓度为0.1-20mM，所述二磷酸尿苷葡糖的浓度为0.1-20mM。

作为优选的实施方式，步骤一的具体操作步骤如下：

摇3-5ml大肠杆菌BL21(DE3)至指数生长期；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细胞；10000g离心1-2min收集细菌；加入1ml、0.1M的氯化钙，重新悬浮细菌，冰浴15-60min；42℃，热激1-2min；加入37℃预热的LB培养基，置于摇床摇1-2小时；离心收菌，将细菌涂于含有卡那霉素的琼脂糖凝胶LB板上。

作为优选的实施方式，步骤二的具体操作步骤如下：

将耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因插入到质粒pET28a中，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因对应的uniprot数据库编号是tll1590，限制性内切酶位点为NdeI和XhoI，耐高温蔗糖磷酸合成酶的cDNA或合成基因末尾加上终止密码子TAA，所获得的质粒命名为pET28a_tll1590；每0.1ml大肠杆菌BL21(DE3)转0.1-10μg质粒pET28a_tll1590。

作为优选的实施方式，所述耐高温蔗糖磷酸合成酶的基因是从细长嗜热聚球藻BP-1中克隆或基因合成得到。

作为优选的实施方式，步骤三的具体操作步骤如下：