[发明专利]一种人自体脂肪间充质干细胞的无血清培养方法

说明书

本发明涉及一种人自体脂肪间充质干细胞的无血清培养方法，具体为选取无菌脂肪组织进行第一次消化，获取第一细胞悬液；对未消化脂肪组织进行第二次消化，获得第二细胞悬液；将第一细胞悬液和第二细胞悬液合并后进行培养、传代、鉴定，得到所述人自体脂肪间充质干细胞。本发明发明的脂肪间充质干细胞培养方法中原代细胞的分离、扩增培养和冻存体系均为无血清培养基，完全避免了动物源成分添加的风险；本发明所述方法采用两步酶消化法，利用消化酶与脂肪组织的特定比例，使脂肪组织充分接触酶溶液，使得脂肪组织得到充分消化，且不会使细胞受损，原代细胞的得率高、活性好、重复性高、安全性好，符合临床应用标准。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种人自体脂肪间充质干细胞的无血清培养方法。

背景技术

自Zuk等2001年成功从脂肪组织分离出干细胞并命名为脂肪间充质干细胞，脂肪来源的间充质干细胞得到极大关注，Zuk等人研究发现从抽脂术中获取的脂肪组织中可以分离出一种程序抽吸细胞(processed lipoaspirate(PLA)cells)，该细胞在体外培养表现出稳定的生长特性，而且在特定环境下可以向多种细胞方向分化，具有干细胞的特征，且与骨髓来源的间充质干细胞相比，脂肪干细胞来源方便，主要来源人腹部、大腿和手臂等，其数量巨大，取材安全简便，在局麻下即可获取大量细胞，体外扩增和自我更新能力很强，失去后对被采集者的影响较小，对受体不存在免疫反应，并且现在主动要求抽脂的人数也越来越多。因此，脂肪间充质干细胞作为一种新的成体干细胞来源有着非常广阔的前景。越来越多的研究显示，组织工程学在组织缺损修复中具有相当的优势。

现在对脂肪干细胞研究方面，原代分离方法多数为一步酶解法，细胞得率有限；培养方法多数为有血清培养法，在临床转化应用时脂肪间充质干细胞作为种子细胞在临床中应用，存在很大瓶颈，有许多待解决的问题：如动物源成分残留，细胞培养体系中外源病毒的引入，及细胞数量及活性生物学功能方面都存在诸多争议，没有明确的安全应用规范，这使干细胞在临床应用中受到很大的限制。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种人自体脂肪间充质干细胞的无血清培养方法，本发明所述方法中原代细胞的分离、扩增培养和冻存体系均为无血清培养基，完全避免了动物源成分添加的风险；本发明所述方法采用的两步酶消化法利用特定的消化酶比例，可以使脂肪组织充分接触酶溶液，使得脂肪组织得到充分消化，且不会使细胞受损，原代细胞的得率高、活性好、重复性高。

本发明所采用的技术方案为：

(1)使用缓冲液将脂肪组织进行洗涤，第一次离心后制得无菌脂肪组织备用；

(2)将所述无菌脂肪组织进行消化，停止消化后进行第二次离心得到细胞沉淀和未消化脂肪组织，所述细胞沉淀在下层，所述未消化脂肪组织在上层；使用缓冲液对所述细胞沉淀进行重悬、过滤，对滤液进行第三次离心，得到沉淀物，使用培养基对所述沉淀物进行重悬，低温保存，得到第一消化细胞悬液；

(3)将步骤(2)中所述未消化脂肪组织进行消化，停止消化后进行第四次离心得到细胞沉淀，将所述细胞沉淀用缓冲液进行重悬、过滤，对滤液进行第五次离心，得到沉淀物，使用培养基对所述沉淀物进行重悬，得到第二消化细胞悬液；

(4)合并所述第一消化细胞悬液和所述第二消化细胞悬液，进行第六次离心后得到细胞沉淀，使用培养基对细胞沉淀进行重悬，接种后依次进行培养、消化、第七次离心，所得细胞沉淀即为P₀代细胞；

(5)使用培养基将所述P₀代细胞进行传代培养，传至P₃代时进行收获并冻存；

(6)对所述P₃代细胞进行细胞表面抗原鉴定，筛选得到合格P₃代细胞，即为所述人自体脂肪间充质干细胞。

进一步的，步骤(1)-(3)中，所述缓冲液为杜氏磷酸缓冲液。