[发明专利]一种喜盐芽孢杆菌及其工业化生产依克多因的方法

说明书

本发明公开了一种喜盐芽孢杆菌及其工业化生产依克多因的方法。本发明首先从日照沿海海泥中分离到一株具有依克多因分泌特性的菌株，然后经突变筛选获得高产依克多因且具有稳定遗传特性的喜盐芽孢杆菌(Halobacillus sp.)FL‑2423，该菌株保藏编号为CGMCC No.18783。上述菌株为中度嗜盐菌，在50‑100g/L NaCl浓度的培养基中发酵培养，胞内合成依克多因，发酵产率达到10‑16g/L。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种喜盐芽孢杆菌及其工业化生产依克多因的方法。

背景技术

依克多因，化学名称为1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，又称四氢嘧啶，是一种环状氨基酸衍生物，是某些微生物应答环境渗透压胁迫所合成的一种渗透压补偿溶质。依克多因应用广泛，不仅仅用于化妆品中起保湿、锁水、抗皱作用，还可以对细胞及大分子物质的活性起稳定作用，如酶、核酸稳定剂等。同时，依克多因在医药方面具有广阔的应用前景及开发价值，既可以作为化疗过程中健康细胞的保护剂，同时对老年痴呆症和帕金森氏病也有一定的预防效果。

基于其特殊的理化特性，高产依克多因的菌种大多是从高盐等极端环境中筛选而出，已报道的高产菌株以嗜盐单胞菌属、海球菌属、芽孢杆菌属居多，且国内外报道的野生菌制备依克多因产量较低，后期提取工艺复杂，所需设备及操作步骤严格、成本高昂，导致目前市场上销售的依克多因价格较高，限制了它的使用范围，也使得消费者对其望而却步，不得不找效果好而价格低廉的替代品代替。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一株喜盐芽孢杆菌(Halobacillus sp.)FL-2423，该菌株为中度嗜盐菌，在发酵培养中降低了盐的使用浓度，在中度盐条件下，分泌于胞内，利于后期的提取。发酵过程中采用谷氨酸钠为唯一碳源的培养基，并选择在较低的盐浓度条件下进行发酵，其发酵产量高，对发酵设备的耐盐性要求低。

本发明首先从日照沿海海泥中分离到一株生长速度快、适应盐浓度范围广、具有依克多因分泌特性的菌株，然后对该菌株进行化学、物理复合诱变育种、筛选，获得高产依克多因且具有稳定遗传特性的突变菌株——喜盐芽孢杆菌(Halobacillus sp.)FL-2423。该菌株已经于2019年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.18783。该菌株的菌落特征如图2所示，16S rDNA序列如序列表SEQ No.1所示。

本发明还提供了采用上述的喜盐芽孢杆菌(Halobacillus sp.)FL-2423工业化生产依克多因的方法，其特征是，

1)种子液培养

将喜盐芽孢杆菌(Halobacillus sp.)FL-2423接种于种子培养基中摇床培养，培养温度为26-32℃，培养时间为16-30小时；

其中，种子培养基的组分及含量：味精20-50g/L，磷酸氢二钾5-15g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，硫酸镁0.2-1g/L，硫酸锰0-0.05g/L，酵母粉1-10g/L，氯化钠20-60g/L，pH 7.0。

优选的，种子培养基组分及含量为：味精25g/L，磷酸氢二钾5g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.01g/L，酵母粉1g/L，氯化钠30g/L，pH 7.0。

2)有氧发酵

将上述种子液以5-10％的接种量(体积比)接种于发酵培养基中，于温度为25℃-30℃下培养24-96小时，得到胞内产依克多因的发酵液。

其中，发酵培养基的组分包括碳源、无机盐和氮源，其中以谷氨酸钠为唯一碳源。无机盐包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和氯化钠，还可以包括硫酸镁、硫酸锰、硫酸铵，添加少量氮源为酵母粉或者蛋白胨。其中适合胞内分泌依克多因的氯化钠浓度为：50-100g/L。