[发明专利]杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法

说明书

本发明涉及一种杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法。本方法以杜仲下胚轴为外植体材料，转基因得到抗性芽，再将抗性芽微嫁接至野生杜仲苗上。本发明方法解决了现有技术中转基因杜仲生根率和存活率很低，生长的根常为畸形根，植株无法生长的问题。本发明方法能获得生长健康、完整的转基因植株。

技术领域

本发明涉及植物生物繁殖技术，具体涉及到杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法，一种利用微嫁接的方法解决杜仲抗性芽生根困难的问题。

背景技术

杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)是我国特有的珍贵树种，仅一属一种，极其珍稀。杜仲还是传统上十分重要的中药材，药用杜仲，即为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，是中国名贵滋补药材。其味甘，性温。有补益肝肾、强筋壮骨、调理冲任、固经安胎的功效。可治疗肾阳虚引起的腰腿痛或酸软无力，肝气虚引起的胞胎不固，阴囊湿痒等症。杜仲能产杜仲胶，这是一种天然高分子材料,是一种重要的化工原料，在工业上有很高的经济价值。杜仲胶为反式聚异戊二烯，杜仲胶可以用于开发热塑性功能材料、热弹性形状记忆材料。它可以用于航空及有关行业轮胎的开发，顺应了国际上以反式胶为主，发展长寿命、高强度、安全、节能″绿色轮胎″的趋势，可以解决长期以来困扰航空业及相关行业中轮胎强度、轮胎寿命、轮胎摩擦放热等一系列重大问题，最大限度地减少由于飞机轮胎爆裂而造成的灾害，为我国国防工业、航空航天工业的发展提供了新型橡胶材料。此外，由于杜仲适生范围广，病虫害少，也是很好的园林绿化及水土保持树种，具有较高的生态效益。通过建立杜仲遗传转化体系来更好的研究其生理生化机制，以此培育更加优良的杜仲新品种，使杜仲更精确服务于人类需求有着重要的意义。

目前已知的杜仲遗传转化体系存在的问题就是抗性芽生根率低，根生长畸形，(Chen R,Namimatsu S,Nakadozono Y,et al.Efficient regeneration of Eucommiaulmoidesfrom hypocotyl explant[J].Biologia Plantarum(Prague),2008,52(4):713-717.),无法得到一株生长完整的转基因杜仲。现有技术中多数的遗传转化体系仅停留在抗性芽和不定芽的阶段。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法，旨在通过直接将杜仲抗性芽微嫁接到生长良好的野生型杜仲无菌苗上，使两个伤面的形成层靠近并扎紧在一起，因细胞增生，彼此愈合成为维管组织连接在一起从而得到完整的转基因杜仲。本发明成功解决了杜仲生根困难，根为畸形根从而使转基因植株无法生长的问题。

杜仲转基因抗性芽微嫁接繁殖方法，包括如下步骤：

(一)接穗材料准备

(1)将种子剥去果皮，消毒后切去种皮仅留下胚在MS固体培养皿进行培养至14天，

(2)将培养14天的杜仲下胚轴切至0.5cm作为浸染材料，在YEP液体培养基中培养含有目标载体的工程农杆菌菌液至OD₆₀₀0.1-0.4，3000rpm离心10min，弃去上清，用重悬液等体积混匀菌体，加入切好的下胚轴，由农杆菌介导转入杜仲的下胚轴中，

(3)无菌滤纸吸取多余菌液后，将侵染后的下胚轴放置于共培培养基中于25℃暗条件培养3d，

(4)将暗培养3d的下胚轴置于筛选培养基中使其发生脱分化和再分化过程，产生带有目的基因的抗性芽；

(5)待抗性芽长至3-4片叶子且长有茎，切下抗性芽作为接穗；

(二)砧木材料准备

将种子剥去果皮，消毒后切去种皮仅留下胚在MS固体培养皿进行培养7天，再转至MS固体培养瓶中，选取长至4周以上，根茎生长正常的杜仲苗作为砧木材料；

(三)嫁接