[发明专利]一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法

说明书

本发明首次采用蔗糖悬浮法对刺激隐核虫包囊进行计数，不仅操作简单、使用方便，而且计数结果准确可靠，大大方便了鱼类刺激隐核虫病的免疫研究。通过向包囊烧杯中添加质量分数为37.5％的蔗糖溶液，搅匀后用移液枪从烧杯中取出20份1ml的蔗糖溶液，最终计算出包囊总量。

技术领域

本发明属于鱼病防治领域，具体涉及一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法。

背景技术

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是一种原生纤毛虫，主要寄生于海水硬骨鱼类的皮肤、鳃和鳍条等部位，大量感染时常引起海水养殖鱼类严重死亡，造成重大经济损失(Colorni，1987；Dickerson，1995；李言伟等，2019)。近年来，由于我国海水养殖的超负荷发展，养殖环境的恶化，刺激隐核虫病已经成为大范围、经常性爆发的烈性传染病，给海水渔业造成重大经济损失。由于海水养殖的开放性特征，很难杜绝刺激隐核虫对鱼体的感染，加之尚无有效的治疗药物和处理方法，使得该病的防治异常困难。目前，主要采用药物和物理防治方法(Colorni and Burgess，1997；蔡泽平等，2001；黄玮等，2004；Yanong，2009)，然而，这些方法存在效果不稳定、危害食品安全等诸多缺陷，且很难达到理想的效果。

研究证实：鱼类对刺激隐核虫感染会产生获得性免疫保护，疫苗接种可能成为防治刺激隐核虫病的有效方法(Yoshinaga et al，1997；Yambot et al，2006；Luo et al，2007；Hatanaka and Hirazawa，2008)。我们课题组展开了刺激隐核虫免疫防治的基础研究和应用研究，研发出了刺激隐核虫幼虫灭活疫苗，该疫苗可给予海水鱼很好的免疫保护(Luo et al，2007；Bai et al，2008；但学明等，2008；Dan et al，2013)。疫苗免疫保护效果评价常用的方法之一是：用非致死剂量刺激隐核虫攻毒，计数免疫组和对照组鱼身体某些部位(如单侧皮肤、胸鳍、鳃等)寄生滋养体的数量，通过比较两组鱼滋养体数量的差异来反映疫苗效果(但学明等，2008；Misumi et al.，2011；Josepriya et al.，2015)。然而，研究发现刺激隐核虫在同一尾鱼不同部位的感染量存在差异，所以该方法不能全面反映整条鱼的感染情况。因此，计数整条鱼身上的刺激隐核虫量更为合理，但实际操作中非常费时费力、极难实现。现常用的方法是：刺激隐核虫感染后，均匀放置几个平皿在桶底，通过计数平皿中收取的包囊量反映感染量。然而，包囊从鱼体脱落后并非均匀分布于桶底，所以该方法也不准确。因此，我们课题组采用感染后将鱼体转移到100L养殖桶内，滋养体脱落完全后收集桶底全部包囊进行计数的方法。每尾鱼脱落包囊的数量成千上万个，计数非常耗时。我们希望通过随机计数多份1ml包囊液中的包囊量来反映总虫量。但包囊较大，密度比海水大，因此在水中很快沉降，很难获得均匀的包囊溶液进行计数。蔗糖是很好的悬浮剂，常用于密度梯度离心分离细胞等。基于此，本研究建立了一种用蔗糖悬浮包囊用以计数的方法。

发明内容

本发明旨在解决从鱼体脱落的刺激隐核虫包囊计数难的问题，提供了一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法，采用独特的蔗糖悬浮法对刺激隐核虫包囊进行计数，不仅操作简单、使用方便，而且计数结果准确可靠。

本发明首创性的采用蔗糖悬浮法来计数刺激隐核虫包囊，获得了准确的实验结果。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种蔗糖悬浮法计数刺激隐核虫包囊的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将感染刺激隐核虫后的鱼体转移到100L养殖桶内，养殖桶内水面高度为60cm。

(2)待滋养体脱落完全后，将鱼体从养殖桶内移出，同时将养殖桶内的水倒出，最终保留约2L水体；用毛刷将包囊轻轻从桶底扫下，并转移到2L烧杯里，待包囊全部沉到杯底后，将水体全部去除，并向烧杯内加入100ml质量分数为37.5％的蔗糖溶液，将包囊和蔗糖溶液全部转移到150ml烧杯中，用玻璃棒搅拌均匀。