[发明专利]一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂，其特征在于：针对猪瘟病毒5’-UTR基因和非洲猪瘟病毒P72基因，分别设计并筛选出能覆盖所有毒株，又适合双重检测的引物和探针，包括二对特异性引物和二条特异性探针，扩增目的片段长度分别为94bp和249bp，引物和探针序列为：

猪瘟病毒：

上游引物CSFV-F：5’-TGCCCAYAGTAGGACTAG-3’

下游引物CSFV-R：5’-CTACTGACGACTGTCCTG-3’

探针CSFV-P：5’-TGGCGAGCTCCCTGGGTGGTCTA-3’

非洲猪瘟病毒：

上游引物ASFV-F：5’-GATACCACAAGATCTGCCGT-3’

下游引物ASFV-R：5’-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-3’

探针ASFV-P：5’-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-3’

所述探针CSFV-P和探针ASFV-P在5’端分别标记不同的荧光报告基团，所述探针CSFV-P和探针ASFV-P在3’端均标记相同或不同的荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂，其特征在于：所述荧光报告基团为FAM或VIC，所述荧光淬灭基团为TAMRA或BHQ。

3.根据权利要求1或2所述的一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂，其特征在于：所述探针CSFV-P在5’端标记FAM，在3’端标记TAMRA；所述探针ASFV-P在5’端标记VIC，在3’端标记BHQ。

4.一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2或3所述的二对特异性引物和二条特异性探针。

5.根据权利要求4所述的一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括反应缓冲液、酶、阳性对照和阴性对照。

6.根据权利要求5所述的一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液为One Step RT-PCRbuffer；所述酶为Ex Taq和PrimeScriptRTEnzyme；所述阳性对照为猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒合成片段的体外重组质粒；所述阴性对照为灭菌去离子水。

7.一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、提取待测样本的DNA和RNA，将RNA反转录成cDNA；

步骤二、以步骤一中所述的DNA和cDNA为模板，利用权利要求4所述的试剂盒进行双重荧光PCR扩增；

步骤三、分析PCR产物，根据扩增反应结果判定待测样本中是否含有猪瘟病毒和/或非洲猪瘟病毒。

8.根据权利要求7所述的一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤二中，猪瘟病毒5’-UTR基因最适上游引物CSFV-F和下游引物CSFV-R的终浓度均为0.4μmol/L，最适探针CSFV-P的终浓度为0.6μmol/L；检测非洲猪瘟病毒P72基因最适上游引物ASFV-F、下游引物ASFV-R的终浓度均为0.6μmol/L，最适探针ASFV-P的终浓度为0.6μmol/L。

9.根据权利要求7所述的一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光PCR检测方法，其特征在于：步骤二中，双重荧光PCR扩增的反应程序为：42℃5min，95℃10s；95℃5s，60℃30s，共45个循环。