[发明专利]一种诱导可可毛色二孢快速产生分生孢子的方法

说明书

本发明公开了一种诱导可可毛色二孢快速产生分生孢子的方法。本发明首先公开了葡萄枝条在诱导可可毛色二孢产生分生孢子中的应用。本发明进一步公开了一种诱导可可毛色二孢产生分生孢子的方法。本发明通过水琼脂培养基和葡萄枝条制备得到的产孢培养基培养可可毛色二孢，极大地缩短了可可毛色二孢产生分生孢子的时间，提高了产孢稳定性且很大程度上也避免了其他杂菌的污染，对研究可可毛色二孢的致病机理、侵染过程、病害发生规律和防治方法等相关研究提供了充分的基础条件，具有较高的应用潜力。

技术领域

本发明属于植物病原真菌诱导产孢技术领域，具体涉及一种诱导可可毛色二孢快速产生分生孢子的方法。

背景技术

可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)是一种重要的植物机会病原真菌，寄主范围十分广泛，可以侵染葡萄、芒果、木瓜，桃等多种多年生木本植物，在适合条件下发病，造成严重损失。当前关于可可毛色二孢的研究报道主要集中在病原菌的分离鉴定、生物学特性、致病力分析等方面，近年来，国内外相关研究人员开始着手其致病机理研究，为该病原菌引起的病害防控提供理论依据。其中，获得病原菌的分生孢子是开展基因功能、侵染过程等研究的关键环节，如何快速、简易地获得大量分生孢子在很大程度上决定了病原菌致病机理的研究进程。现有技术下，可可毛色二孢人工培养过程中存在分生孢子难产生且周期长的问题，从而导致相关研究进展缓慢。

目前获得可可毛色二孢分生孢子的主要方法是用传统PDA培养基进行培养，等待其产孢，或者在进行PDA培养基培养时，采用日光或者紫外光照射破坏其正常生长环境以及培养3-5天之后打断菌丝等措施促进其产孢。利用上述方法通常情况下需要1个月甚至更长时间才能获得可可毛色二孢的分生孢子，而且产孢量不稳定，无法在短时间内为获取致病力分析、分生孢子侵染过程等研究提供所需的大量的分生孢子悬浮液。

因此，建立一种可可毛色二孢简易、快速、大量的分生孢子产孢技术体系，是本领域亟待解决的技术问题，也是对此类真菌的致病机理、侵染过程和寄主抗病品种的培育等研究的重要条件，而目前国内外尚未见可可毛色二孢快速稳定产孢的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为如何诱导可可毛色二孢快速稳定产孢，且避免培养过程中的杂菌污染。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了葡萄枝条在诱导可可毛色二孢产生分生孢子中的应用。

本发明进一步提供了一种诱导可可毛色二孢产生分生孢子的方法。

本发明诱导可可毛色二孢产生分生孢子的方法，包括将可可毛色二孢接种至产孢培养基培养，诱导可可毛色二孢产生分生孢子；

其中，所述产孢培养基由葡萄枝条和水琼脂培养基制备而成。

上述方法中，所述水琼脂培养基由水和琼脂制备而成，所述琼脂的浓度为20g/L；

所述葡萄枝条和水琼脂培养基的质量比为1∶25。

具体的，所述产孢培养基的制备方法为：取琼脂，加水定容，灭菌，得到灭菌的水琼脂培养基；将葡萄绿枝条切4-6cm小段(例如4cm、5cm或6cm)，灭菌，烘干，得到灭菌的葡萄枝条；每皿中加灭菌的葡萄枝条和灭菌的水琼脂培养基，得到产孢培养基。

在本发明具体的实施方式中，所述产孢培养基的制备方法为取琼脂20g，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌锅灭菌20min，得到灭菌的水琼脂培养基；将葡萄绿枝条切4-6cm小段，于121℃高压灭菌锅灭菌20min，置于90℃烘箱2h烘干，得到灭菌的葡萄枝条；每皿中加20g灭菌的水琼脂培养基和0.8g灭菌的葡萄枝条，使葡萄枝条大部分暴露在水琼脂培养基的外面，得到产孢培养基。

上述方法中，所述培养为在温度为28℃的条件下，14h光照10h黑暗培养9-13天(例如可以为9天、10天、11天、12天或13天)。